睡眠要求を生み出す単一ニューロンレベルの多層ダイナミクスの可視化

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K19410
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 船戸 弘正 東邦大学, 医学部, 教授 (90363118)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 成清 公弥 東邦大学, 医学部, 助教 (70599836)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2025-03-31
• Keywords: 睡眠 / 徐波 / 細胞内シグナル

Outline of Annual Research Achievements

睡眠は脊椎動物に見られるありふれた行動であるが、睡眠の定義の広がりと検出方法の高度化によりショウジョウバエ、クラゲ、ヒドラも「眠る」ことが明らかとなってきた。脳を持たない動物も眠ることから、シンプルな神経系でも「眠る」ことができる。本研究ではマウスをモデル動物として用いて、睡眠覚醒を司る中枢神経系における細胞レベルでの睡眠の基盤解明を目指している。
初年度は、対物レンズ、CCDカメラ、LED光源等を組み合わせたイメージングや脳波記録のセットアップを行った。頭部固定はストレスになるために通常頭部固定したマウスは入眠しなかったりレム睡眠に入らないが、馴化方法の工夫により頭部を固定した状態で明暗の概日リズムに同期して、覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠の出現を示すようになった。
自然な睡眠覚醒を示すマウスの皮質脳波を記録することができるようになっている。睡眠制御分子SIK3のアデノ随伴ウイルスを用いた発現による皮質脳波から徐波成分を中心に様々な解析を行っている。投与の量や部位、アデノ随伴ウイルスのタイプを調整して測定系の最適化を行った。脳波測定やイメージングに加えて、DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）と呼ばれる遺伝薬理学的な手法とFosプロモーターを利用した細胞ラベリングを組み合わせたより操作的な実験も開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

SLP変異型SIK3を全身性にもしくは神経系のみで発現させるとノンレム睡眠時間が延長し、ノンレム睡眠中の徐波成分が増大する。PHP.eB型アデノ随伴ウイルスを用いてSLP変異型SIK3を脳に発現させると顕著にノンレム睡眠中の徐波が増大した。ノンレム睡眠時間も延長した。SLP変異型SIK3マウスにリン酸化を受けないようにアミノ酸置換した基質分子をアデノ随伴ウイルスを用いて脳に後半に発現させると、SLP変異によるノンレム睡眠増大がキャンセルされることも確認した。ノンレム睡眠時間も延長した。大脳皮質運動野局所へのアデノ随伴ウイルス投与によって、SLP型SIK3を限局した大脳皮質領域で発現させ、大脳皮質の異なる部位から皮質脳波を取得した。蛍光蛋白の発現により発現範囲を検討した。左右半球での異なりもあるが個体差もあり慎重に検討を進めている。計画通りにマウスを頭部固定装置に固定した状態で、対物レンズ、CCDカメラ、LED光源を組み合わせたイメージングや脳波記録のセットアップができた。マウスの馴化方法も改善し問題なく稼働している。脳波測定やイメージングに加えて、DREADD（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）と呼ばれる遺伝薬理学的な手法とFosプロモーターを利用した細胞ラベリングを組み合わせたより操作的な実験も開始した。

Strategy for Future Research Activity

マウスを用いて自然な睡眠覚醒のなかでのノンレム睡眠中序波成分を検討するため、個体差や手術侵襲、アデノ随伴ウイルス局所投与による影響を排除できることが好ましい。時間的に継続して変化が評価できるようにTet-Offシステムを用いる。SLP変異型SIK3をTREの下流に配置しさらに蛍光蛋白質をつないだアデノ随伴ウイルスと逆テトラサイクリン応答性転写活性化因子ｒtTAを発現するアデノ随伴ウイルスを組み合わて投与する。ドキシサイクリンを投与してSLP変異型SIK3発現を抑えておき、ドキシサイクリンを中止すると数日でSLP変異型SIK3発現が誘導されることになる。この前後で同じ部位から脳波を測定することでSLP変異型SIK3発現の効果を検討する。加えて、投与の量や部位、アデノ随伴ウイルスのタイプもPHP.eBからB10へ変更するなど検討する。

Causes of Carryover

機器のセットアップを中心に行ったため本年度は消耗品使用を計画よりも減らして次年度に効率的に使用することにしたために次年度使用額が生じた。
次年度は、当初の計画通り実験用試薬及び解析関係費用等に充てる。

Research Products

• [Journal Article] SIK3-HDAC4 in the suprachiasmatic nucleus regulates the timing of arousal at the dark onset and circadian period in mice (2023)
  • Author(s): Asano Fuyuki、Kim Staci J.、Fujiyama Tomoyuki、Miyoshi Chika、Hotta-Hirashima Noriko、Asama Nodoka、Iwasaki Kanako、Kakizaki Miyo、Mizuno Seiya、Mieda Michihiro、Sugiyama Fumihiro、Takahashi Satoru、Shi Shoi、Hirano Arisa、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 120 Pages: e2218209120
  • DOI: 10.1073/pnas.2218209120
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] D1- and D2-type dopamine receptors are immunolocalized in pial and layer I astrocytes in the rat cerebral cortex (2023)
  • Author(s): Oda Satoko、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Neuroanatomy Volume: 17 Pages: 1111008
  • DOI: 10.3389/fnana.2023.1111008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A signalling pathway for transcriptional regulation of sleep amount in mice (2022)
  • Author(s): Zhou Rui、Wang Guodong、Li Qi、Chen Zhiyu、Chen Lin、Shi Bihan、Wang Haiyan、Wang Xia、Li Huaiye、Cai Tao、Li Bin、Wang Fengchao、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi、Zhang Eric Erquan、Liu Qinghua
  • Journal Title: Nature Volume: 612 Pages: 519～527
  • DOI: 10.1038/s41586-022-05510-6
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Kinase signalling in excitatory neurons regulates sleep quantity and depth (2022)
  • Author(s): Kim Staci J.、Hotta-Hirashima Noriko、Elhosainy Asmaa、Mizuno Seiya、Miyazaki Shinichi、Tsuneoka Yousuke、Sugiyama Fumihiro、Takahashi Satoru、Hayashi Yu、Muratani Masafumi、Liu Qinghua、Miyoshi Chika、Yanagisawa Masashi、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Nature Volume: 612 Pages: 512～518
  • DOI: 10.1038/s41586-022-05450-1
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fluorescence quenching by high-power LEDs for highly sensitive fluorescence in situ hybridization (2022)
  • Author(s): Tsuneoka Yousuke、Atsumi Yusuke、Makanae Aki、Yashiro Mitsuru、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Molecular Neuroscience Volume: 15 Pages: 976349
  • DOI: 10.3389/fnmol.2022.976349
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] IκBζ controls IL-17-triggered gene expression program in intestinal epithelial cells that restricts colonization of SFB and prevents Th17-associated pathologies (2022)
  • Author(s): Yamazaki Soh、Inohara Naohiro、Ohmuraya Masaki、Tsuneoka Yousuke、Yagita Hideo、Katagiri Takaharu、Nishina Takashi、Mikami Tetuo、Funato Hiromasa、Araki Kimi、Nakano Hiroyasu
  • Journal Title: Mucosal Immunology Volume: 15 Pages: 1321～1337
  • DOI: 10.1038/s41385-022-00554-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] OX2R-selective orexin agonism is sufficient to ameliorate cataplexy and sleep/wake fragmentation without inducing drug-seeking behavior in mouse model of narcolepsy (2022)
  • Author(s): Yamamoto Hikari、Nagumo Yasuyuki、Ishikawa Yukiko、Irukayama-Tomobe Yoko、Namekawa Yukiko、Nemoto Tsuyoshi、Tanaka Hiromu、Takahashi Genki、Tokuda Akihisa、Saitoh Tsuyoshi、Nagase Hiroshi、Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 17 Pages: e0271901
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0271901
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Hunt for mammalian sleep-regulating genes (2022)
  • Author(s): Funato Hiromasa、Yanagisawa Masashi
  • Journal Title: Brain Science Advances Volume: 8 Pages: 173～182
  • DOI: 10.26599/BSA.2022.9050012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mice Lacking Cerebellar Cortex and Related Structures Show a Decrease in Slow-Wave Activity With Normal Non-REM Sleep Amount and Sleep Homeostasis (2022)
  • Author(s): Fujiyama Tomoyuki、Takenaka Henri、Asano Fuyuki、Miyanishi Kazuya、Hotta-Hirashima Noriko、Ishikawa Yukiko、Kanno Satomi、Seoane-Collazo Patricia、Miwa Hideki、Hoshino Mikio、Yanagisawa Masashi、Funato Hiromasa
  • Journal Title: Frontiers in Behavioral Neuroscience Volume: 16 Pages: 910461
  • DOI: 10.3389/fnbeh.2022.910461
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Kinase signaling pathway regulating non-REM sleep (2023)
  • Author(s): 船戸弘正
  • Organizer: 第100回日本生理学会
  • Invited
• [Presentation] Physiological changes during physical contact with caregivers in mammalian infants and their involvement in attachment formation (2023)
  • Author(s): Sachine Yoshida, Hiromasa Funato
  • Organizer: 第100回日本生理学会
• [Presentation] Neural ensembles activities underlying consolation-like behavior in mice (2022)
  • Author(s): Ryo Saito, Deependra Kumar, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa, Aiba A.
  • Organizer: Neuro 2022 日本神経学学会
• [Presentation] Social buffering of isolation by somatosensory stimulation in mouse pups (2022)
  • Author(s): Sachine Yoshida, Hiromasa Funato
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] GABAergic neurons in ventral midbrain/pons are involved in mania-like behaviors with altered sleep homeostasis and sleep architecture (2022)
  • Author(s): T. HONDA, Y. TAKATA, Y. CHERASSE, S. MIZUNO, F. SUGIYAMA, S. TAKAHASHI, H. FUNATO, M. YANAGISAWA, M. LAZARUS, Y. OISHI
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Intracellular signaling components in homeostatic regulation of sleep (2022)
  • Author(s): Staci J. Kim, Shinya Nakata, Noriko Hotta-Hirashima, Nodoka Aasama, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Satomi, Seiya Mizuno, Satoru Takahashi, Chika Miyoshi, Hiromasa Funato, Masasyi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Sik3 regulates circadian rhythms and sleep need through distinct neuron types and brain regions. (2022)
  • Author(s): Fuyuki Asano, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Tomohiro Kitazono, Staci J. Kim, Kanako Iwasaki, Noriko Hotta-Hirashima, Miyo Kakizaki, Aya Ikkyu, Satomi Kanno, Shinya Nakata, Nodoka Asama, Takumi Tsukamoto, Arisa Hirano, Seiya Mizuno, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Sleep/wake behavior of mice lacking PKA phosphorylation sites in SIK3 (2022)
  • Author(s): Minjeong Park, Takato Honda, Kanako Iwasaki, Chika Miyoshi, Tomoyuki Fujiyama, Miyo Kakizaki, Aya Ikkyu, Seiya Mizuno, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Involvement of microglia in sleep/wake regulation in baseline conditions and under acute social defeat stress in mice (2022)
  • Author(s): Kazuya Miyanishi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Kinase activity of SIK3 has a crucial role in sleep homeostatic regulation (2022)
  • Author(s): Shinya Nakata, Haruna Abe-Komiya, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Aya Ikkyu, Fuyuki Asano, Kanako Iwasaki, Seiya Mizuno, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Regulation of sleep amount by SIK3 in hypothalamic nuclei (2022)
  • Author(s): Kanako Iwasaki, Tomoyuki Fujiyama, Shinya Nakata, Minjeong Park, Chika Miyoshi, Noriko Hotta-Hirashima, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Yukiko Ishikawa, Fumihiro Sugiyama, Seiya Mizuno, Manabu Abe, Kenji Sakimura, Satoru Takahashi, Hiromasa Funato, Masashi Yanagisawa
  • Organizer: Society for Neuroscience 2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 高感度超多重ISH法から観る内側視索前野のオス性行動における機能 (2022)
  • Author(s): 恒岡洋右、船戸弘正
  • Organizer: 第48回日本神経内分泌学会
• [Presentation] 非選択的陽イオンチャネルNalcn遺伝子改変マウスを用いたレム睡眠制御機構の解析 (2022)
  • Author(s): 藤山 知之、管野 里美、堀田 典子、柿﨑 美代、一久 綾、恒岡 洋右、阿部 学、望月 綾子、セオーネコラッゾ パトリシア、宮崎 峻弘、水野 聖哉、三好 千香、上田 壮志、渡辺 雅彦、崎村 建司、高橋 智、船戸 弘正、柳沢 正史
  • Organizer: Neuro 2022 日本神経学学会