Development of a high-throughput functional evaluation system focusing on the stability of missense variants

2023 Fiscal Year Final Research Report

• Project/Area Number: 22K19488
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 52:General internal medicine and related fields
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: Saitsu Hirotomo 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
• Project Period (FY): 2022-06-30 – 2024-03-31
• Keywords: ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体

Outline of Final Research Achievements

In this study, we established a high-throughput screening analysis system to assess missense variants impacting protein stability by expressing a GFP fusion protein. Upon creating 104 clones of GFP fusion random mutants and conducting fluorescence evaluation and sequencing on 24 of them, we observed that fluorescence intensity remained consistent even in clones harboring 7 variants with high pathological prediction scores. This underscores the notion that in silico pathological prediction scores serve merely as reference points, emphasizing the crucial role of functional evaluation.

Free Research Field

分子遺伝学

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

遺伝子解析において、1アミノ酸の置換に過ぎないミスセンスバリアントは病的意義不明のバリアントと分類されることが多く、その機能評価が重要な課題となっている。本研究で確立した蛍光強度に基づいたタンパク質安定性のハイスループットスクリーニングは、遺伝子産物でも適用可能であり、かつ特別な機器を必要としない。この挑戦的研究によりProof of Conceptとなる研究成果を得ることで、希少疾患の原因遺伝子においてミスセンス変異タンパク質の安定性データベースが多くの研究者によって構築され、分子構造の理解とバリアントの解釈に大いに貢献することが期待できる。