2022 Fiscal Year Research-status Report
The investigation of molecular mechanisms underlying refractory respiratory diseases using human lung derived organoids
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22K19560
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
新谷 康 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (90572983)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大瀬 尚子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (10570559)
舟木 壮一郎 大阪大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (50464251)
狩野 孝 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70528455)
福井 絵里子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (90814591)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | 慢性閉塞性肺疾患 / 特発性間質性肺炎 / オルガノイド培養技術 / 薬剤スクリーニング / 幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
呼吸器領域では慢性閉塞性肺疾患（COPD）や特発性間質性肺炎など非可逆性の慢性進行性の肺疾患が急増しており、さらに新型コロナウイルスCOVID-19の後遺呼吸器障害による難治性呼吸器疾患に対する治療法の開発は重要な課題となる。少量のヒト由来組織を用いて、正常肺、COPD肺などの疾患由来組織によるオルガノイド作成技術を開発し、気道上皮肺オルガノイドを用いた難治性呼吸器疾患の病態解明、薬剤スクリーニング情報源としての役割評価および個別化医療を促進するバイオバンク構築を目的として本研究を計画した。
まず、成人および小児正常肺よりオルガノイドを作成する技術を確立し、さらに継代できる培養条件を探索した。当科で肺切除を行った症例から、余剰肺組織を得てⅡ型肺胞上皮を抽出し3次元培養を開始してオルガノイドを樹立した。うち継代し得るものを選択し、各種実験に使用できることを確認した。
今後、疾患肺よりオルガノイドを作成し、遺伝子・蛋白発現を解析し、疾患特異的な発現分子やシグナル伝達経路を探索する。さらに、１細胞RNAシークエンシング法により、オルガノイドに含まれる全ての細胞種と機能を評価する。成人正常肺由来オルガノイドと小児正常肺由来オルガノイド、正常肺由来オルガノイドと疾患肺オルガノイドを対比させることで、気道上皮肺の発生機序に重要な幹細胞群、疾患の病態に関連する細胞群を同定することを計画している。さらに正常肺由来オルガノイドを対照として、既存薬ライブラリーを使用し疾患由来オルガノイドの変化を観察することで、新たな創薬になりえる化合物を探索する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当科で肺切除症例12例を対象に、余剰肺組織の研究使用、組織培養、網羅的遺伝子解析実施についてインフォームドコンセントを得た上で、肺切除直後に無菌状態で1cm立方の肺組織を得た。得られた肺組織を尖刀にて細分化し、プロテアーゼ処理により細胞レベルに分離させ、EpCAMとHTII-280の抗体を用いてソーティング後Ⅱ型肺胞上皮を抽出し、マトリゲルで包埋しメディウムを加えて3次元培養しオルガノイドを樹立した。うち継代し得るものは6例分であった。安定して継代できたオルガノイドをホルマリン固定し、HE染色、細胞接着分子（E-cadherin、ZO-1）による免疫染色を行ったところ形態評価が可能であることを確認した。
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| Strategy for Future Research Activity |
蓄積したオルガノイド中からViabilityの高いオルガノイドを用いて、遺伝子・蛋白発現解析、さらには１細胞RNAシークエンシング法により細胞種およびその機能を評価する。
成人正常肺由来オルガノイドと小児正常肺由来オルガノイド、正常肺由来オルガノイドと疾患肺オルガノイドを対比させることで、気道上皮肺の発生機序に重要な幹細胞群、疾患の病態に関連する細胞群を同定する。
抗炎症薬、抗線維化薬による疾患由来オルガノイドの変化を観察する。
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| Causes of Carryover |
オルガノイド培養に必要なマトリゲルの供給不足のため、一時オルガノイド作成を休止した。本年度は、培養に必要なマトリゲルや成長因子などの高価な試薬を購入する必要性から、一部の経費を次年度に使用することとした。
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