2023 Fiscal Year Research-status Report
Understanding of initiation signals of intercellular mitochondria transfer
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22K19574
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
三木 敏生 日本大学, 医学部, 教授 (80845305)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太向 勇 日本大学, 医学部, 助手 (20836556)
堀江 真史 金沢大学, 医学系, 准教授 (60732659)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / 細胞間水平移動 / 網羅的遺伝子解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ミトコンドリアの細胞間水平移動のメカニズムについて、特にミトコンドリアの移動がどのように開始されるのかについて解明し、細胞間コミュニケーションを制御するための知見を得ることである。これにより、がん細胞の耐性獲得の阻止や酸化ダメージを受けた組織の修復を目的とする新しい治療方法の開発が期待される。本研究では、レンチウイルスベクターを用いて遺伝的に蛍光ラベルしたミトコンドリアを持つ細胞株を用いる。この実験系により、ミトコンドリアを受け取った細胞と受け取らなかった細胞をフローサイトメーターを用いて分別することが可能になり、それぞれのトランスクリプトームを網羅的に解析して、ミトコンドリア移送開始の契機となるシグナルを探求する。令和4年度は、ミトコンドリアの細胞間水平移動のメカニズムを検討するために適切な赤色蛍光タンパクの選定を行い、このシステムを用いて予備的にフローサイトメーターを用いて分別した細胞のRNAseq解析を行ったが、サンプル間に大きなばらつきがあったため、令和5年度はその原因究明とトラブルシューティングを行なった。その結果、レシピエント細胞株によりミトコンドリア移送効率に差があることや過酸化水素暴露によるミトコンドリアの傷害誘導に問題があること、またフローサイトメーターを用いた細胞分別の際のゲート設定が困難であることが判明した。そこで、これらの問題点を解決し、再びフローサイトメーターを用いてサンプルを調整し、RNAseq解析を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和4年度に行った予備的RNAseqの結果サンプル間に大きなばらつきがあったため、令和5年度はその原因究明とトラブルシューティングを行なった。現在新しいレシピエント細胞を選定し、FACSのゲート調整を厳密に行うなど改善したサンプルを用いて、再びRNAseqを外部委託し結果を待っているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
再度行ったRNAseqの結果が戻り次第、データの解析を行い、得られた差次的発現遺伝子データの結果からミトコンドリア移送に関わると思われる遺伝子の同定を行う。選抜した候補遺伝子の機能を探索するため、multi-shRNA法および発現ベクターを用いた遺伝子導入により機能欠失/機能獲得(LOF/GOF)実験を行い、機能的遺伝子の同定およびシグナル伝達経路を同定する。
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| Causes of Carryover |
RNAseqの納品が令和6年度にずれ込んでいるため、次年度使用額で請求される予定である。また、上記の理由で令和5年度に予定していた遺伝子同定やその確認実験、また機能欠失/機能獲得化(LOF/GOF)実験などが令和6年度にずれ込む予定である。
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