2022 Fiscal Year Research-status Report
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22K19618
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川端 重忠 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (50273694)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山口 雅也 大阪大学, 大学院歯学研究科, 准教授 (00714536)
住友 倫子 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(歯学域), 教授 (50423421)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Keywords | ファージ療法 / 耐性化 / 抗CRISPR分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究計画では、新たな感染症治療薬候補としての、細菌の耐性化を回避する人工合成ファージの創出を目指す。近年、感染症の新たな治療戦略としてファージ療法が注目されている。通常バクテリオファージはヒトに感染しないため、特異性が高く薬剤耐性菌に対する新たな切り札となりうる。一方で、細菌はCRISPR-Cas機構などにより、ファージ耐性を獲得する。本研究では、ヒトの口腔や咽頭由来のレンサ球菌を宿主細菌として、日本の臨床分離株に分布するファージ配列の探索を行うとともに、細菌のファージ耐性機構を突破する能力を付与した人工合成ファージを作製して、耐性化しにくいファージ療法の探索を行う。
本年は、当教室で収集しているレンサ球菌200株について、ドラフトゲノム配列の解読を行った。得られたシーケンスデータについて、fastpによるデータクリーニング、SKESAを用いたde novo assemble、Prokkaによる遺伝子のアノーテションを実施した。また、細菌種の同定はANI解析による95%以上の一致を判定基準とした。バクテリオファージ配列ならびにゲノム配列中のプロファージ配列の解析について、2022年度にかけて複数の手法が新たに報告された。本計画では、広く用いられているファージ配列解析サーバーであるPHASTERに加え、ファージのアノテーションツールpharokkaや、ファージゲノムのアノテーションと解析のためのオンライン統合プラットフォームPhaGAAなどを用いて、本研究目的に対する有用性の評価を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
レンサ球菌ゲノムの解析は当初の予定以上の株数の解読を実施した。一方で、得られたゲノム配列に含まれるファージ配列の解読及び解析に時間を要している。総合的に勘案し、「やや遅れている」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
原則的に、当初の研究計画に沿って実施を行う。
得られた配列から、ファージの分子系統解析を行う。また、ファージの特異性を解明するため、菌への結合に寄与するファージタンパク質を決定し、分類する。主要なタンパク質については結晶構造解析を試みるとともに、実験により決定された構造に匹敵する質で構造を予測できるAlphaFold2（Jumper J. et al. Nature, 596: 583-589. 2021）を用いた解析を行う。
溶菌性ファージのゲノムDNAに、制限酵素やDNAアッセンブル技術を用いて、抗CRISPR分子をコードする遺伝子を組み込む。また、得られたファージゲノムを宿主細菌に導入し、人工合成ファージの組み立てを行う。ファージ野生株とCRISPR耐性株を用いて、それぞれ宿主細菌へ混和することで感染させる。菌液の吸光度を測定することで溶菌活性を測定し、継代培養することで細菌が耐性を獲得するまでの時間を比較する。細菌が耐性を獲得した場合、細菌ゲノムを抽出し、次世代シーケンサーによる解読を行うことでCRISPR部位の配列変化の検証と耐性部位の決定を行う。さらに、マウス感染モデルを用いたファージ療法の効果の検証を試みる。
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| Causes of Carryover |
ファージ解析に時間を要しているため、分子生物学的な実験が当初の予定よりも少なくなった。当初の計画に沿った形での使用を想定している。
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[Journal Article] Pneumococcal BgaA promotes host organ bleeding and coagulation in a mouse sepsis model.2022
Author(s)
Takemura M, Yamaguchi M, Kobayashi M, Sumitomo T, Hirose Y, Okuzaki D, Ono M, Motooka D, Goto K, Nakata M, Uzawa N, Kawabata S.
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Journal Title
FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY
Volume: 12
Pages: 844000
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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