2022 Fiscal Year Research-status Report
オス減数分裂における性染色体に特異的なDNA損傷応答を司る分子基盤の解明
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22K20635
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
阿部 洋典 熊本大学, 発生医学研究所, 特任助教 (20914964)
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| Project Period (FY) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| Keywords | 減数分裂 / 性染色体不活化 / 精子形成 / DNA 損傷応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オス減数分裂では減数分裂のある時期を境に性染色体全体からの遺伝子発現が減数分裂の完了まで抑制される (性染色体不活化)。これまでに性染色体不活化の分子メカニズムとして、DNA損傷応答 (DDR) シグナルで機能する因子が遺伝子発現抑制の開始機構に必須であることが知られている。さらに申請者の研究から恒常的な DDR シグナルの活性化が長期的な遺伝子発現抑制を維持する分子メカニズムであることが分かった。性染色体上の DDR シグナルは ATR キナーゼ依存的に活性化されることから、本研究では性染色体不活化を維持するために ATR を性染色体上へ恒常的にリクルートする減数分裂特異的な分子メカニズムが存在すると仮説を立て、その解明を目指している。研究方針として性染色体上で ATR と相互作用する因子を質量分析により同定し、減数分裂特異的な因子を見出すことを計画した。具体的な手法としてアフィニティー精製用に 3xFLAG-HA タグをノックインしたマウスツールを作成した。ATR へのタグの導入が ATR のキナーゼ活性に影響を与える可能性を考慮し、本研究では ATR の活性化に機能する相互作用因子 ATRIP に精製タグを導入することにした。ATRIP は ATR と相互作用する領域を C 末側に持つことから、本件度は N 末側にタグを導入したマウスを作成した。しかしながら同マウスでは腫瘍が発生して生殖可能齢に達する前に死亡した。また生存したマウス個体も不妊であった。これらの結果は N 末側へのタグ挿入は ARTIP の機能を阻害し、KO のような表現型をもたらしたためと考えられる。代替手法として ATRIP の C 末側への精製タグ導入したマウスの作出に着手している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では内因性の ATRIP に精製タグをノックインした新規マウスを作出した。しかしながらノックインマウスの作出効率が低く、計画通りの精製タグが導入されたマウス個体がほとんど得られなかった。更に得られたマウスの腫瘍による死亡や他のマウスも不妊であったことから、本年度はマウスコロニーを樹立することができなかった。マウスの作出が困難であった理由として、ATRIP が細胞の生存に非常に重要であることが考えられる。ATR-ATRIP が惹起する DDR は体細胞分裂の S 期における DNA 修復に重要である。そして ATRIP の N 末側は損傷 DNA の目印である一本鎖 DNA に集積する RPA と相互作用して ATR を損傷 DNA 領域へリクルートして DDR シグナルを惹起する。これらのことから、N 末側に導入した精製タグにより ATRIP の機能が阻害され、DDR シグナルに問題が生じたことが腫瘍発生や不妊に繋がったと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
代替マウスとしてATRIP の C 末側に精製タグを導入したマウスの作出に着手している。ATRIP は C 側末に ATR と相互作用するドメイン構造を持つため、精製タグが ATR と ATRIP の相互作用に影響する可能性がある。精製タグによる影響を軽減するため、新規作出中のマウスでは ATRIP と精製タグ間のリンカーとして 3xグリシンを挟んだノックインアレルを設計している。もし同マウスの作出が困難な場合には、より長いリンカーを挿入したマウスモデルモデルの作出やTOPBP1 など他の ATR 相互用因子に精製タグを導入することで ATR と相互作用する未知の因子を捉える計画である。
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