光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィーを用いた神経細胞極性形成期の細胞骨格研究

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K20680
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 吉原 壮悟 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60963973)
• Project Period (FY): 2022-08-31 – 2024-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / クライオ電子線トモグラフィー / 光遺伝学 / アクチン / 細胞極性 / Rac1

Outline of Annual Research Achievements

脳の情報処理機能を司る神経細胞の極性形成には、アクチンや微小管などの細胞骨格ネットワークが重要な役割を担っている。しかし、現在の光学顕微鏡的実験系では、極性形成過程を細胞内で観察することは困難であり、その分子機構の解明はほとんど進んでいない。そこで本研究では、光遺伝学とクライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)とを組み合わせたタイムラプスCryo-ET法により、細胞骨格ネットワークの微細な形態変化過程を捉え、極性の形成機序や疾患の発症原因を解明することを目的としている。
クライオ電子線トモグラフィーによる細胞骨格ネットワークの超微細構造解明のためには、グリッド上への細胞播種密度や接着条件、およびグリッド浸漬凍結装置の種類やその設定などを慎重に検討することが重要である。そこで本年度は、まず野生型海馬神経細胞を用いてこれらを精査し、その最適条件を得た。次に、極性形成過程の観察を行うべく、F-actinの蛍光標識であるLifeact-EGFPに加えて、アクチン繊維のネットワークを形成させる光遺伝学ツールPA-Rac1を海馬神経細胞に導入した。そして光照射時間による、ネットワークの活性化を定量的に解析した。得られたデータを用いて、Rac1活性化のタイムコースを設けた試料を浸漬凍結装置Vitrobotによって急速凍結し、様々な時期の試料を得ることに成功した。そして、試料を凍結したまま観察可能なクライオ蛍光顕微鏡Cryo EM CLEMを用いてグリッド全体を撮影し、PA-Rac1の発現と、Lifeact-EGFPの蛍光像から観察に適した部位を同定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

グリッド上への細胞播種や凍結条件、光照射によるアクチン細胞骨格の活性化解析に加え、クライオ蛍光顕微鏡による観察部位の同定を終えたため、順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

クライオ蛍光顕微鏡で同定した観察に適した箇所を、透過型クライオ電顕Titan Kriosを用いてトモグラフィー撮影する。得られた画像は画像解析　データはIMOD/Etomoを用いて立体構造を構築する。アクチン繊維の長さや配向、分岐などを3D 可視化解析ソフトウェアAmiraにて繊維解析ツールであるX-fiberを用い、解析する。

Causes of Carryover

入念な予備検討により、共同研究先にて行っている試料作製の回数を、当初の予想よりも抑えることができ、旅費が少なくなったことが次年度使用額が生じた理由である。