軟骨欠損に対する新規再生医療の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K20978
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 横山 裕介 岡山大学, 大学病院, 助教 (50596038)
• Project Period (FY): 2022-08-31 – 2024-03-31
• Keywords: 軟骨再生 / iPS細胞 / ３Dバイオプリンター

Outline of Annual Research Achievements

膝関節の大きな骨・軟骨欠損は外傷や変形性関節症、腫瘍など様々な疾患が原因となり、患者数も多いが、十分な再生医療方法は確立されていない。最近、再生医療分野で3Dバイオプリンターを用いた人工臓器の開発が進んでいる。申請者らは3Dプリンターで製作した骨・関節モデルを臨床応用してきた。また、ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）を用いて高い軟骨分化指向性を有し、拡大培養可能で品質管理が可能なヒト軟骨前駆細胞を大量に調整する技術の開発に成功した。そこで、本課題ではiPS細胞と3Dバイオプリンターを用いたハイブリッドマテリアル（iPS細胞と人工骨の融合）による新規骨・関節再建法を開発する目的で、膝軟骨欠損モデル動物を作成し有効性を確認する。現在、下記の研究を行った。
①ヒト軟骨前駆細胞の準備
ヒトiPS細胞株３種（414C2, HPS1042, 771-3G, CiRA HLAホモドナー株）を、Primitive streak誘導培地にて1日処理後、側板中胚葉誘導培地にて1日処理した。この後、CHIR(GSK3b inhibitor)、A83-01(ALK5 inhibitor)、FGF2にて処理することで、肢芽間葉系細胞（ヒト軟骨前駆細胞）へ誘導させた。5-6継代培養し、細胞をストックした。各ロットのヒト軟骨前駆細胞の品質（軟骨形成能の前向き評価）は、特定のCD抗原の発現（CD90陽性CD140B陽性CD82陰性）と、2/3次元培養による軟骨細胞分化能・球状組織塊の軟骨組織の形成能より評価した。
②3Dバイオプリンターによるハイブリッドマテリアルの作製
3Dバイオプリンターでpolycaprolactoneを用いて格子状の立体的な構造物 (scafford)を作製した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト軟骨前駆細胞の準備および3Dバイオプリンターによるハイブリッドマテリアルの作成が計画通り実施できたため。

Strategy for Future Research Activity

免疫不全SCIDラット（F344-Il2rgem1Iexas）あるいはラビット(タクロリムス投与)の近位脛骨の内側部を切除し大欠損を作製し、ハイブリッドマテリアルを移植する。移植3-6か月後に移植組織体の性状・ホスト側組織との適合性を確認する。移植したヒト軟骨前駆細胞/軟骨組織体を組織学的観察（硝子軟骨マーカーであるSafranin O染色や、Type II collagen/Type X collagen/PRG4などの軟骨組織マーカーの免疫染色）を実施する。また、ヒト核抗原抗体を使用した染色を実施することで、移植体（ヒト由来）とホスト側軟骨組織との適合性/連続性について確認する。

Causes of Carryover

コロナの影響でweb参加のこともあり、旅費が予想よりも少なかったため。使用計画としては次年度実施予定の動物実験に必要な費用に充当する。