2022 Fiscal Year Research-status Report
抜歯窩と大腿骨骨欠損部の治癒過程から探る骨格部位依存的な幹細胞の多様性
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22K21025
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| Research Institution | Tokyo Dental College |
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Principal Investigator |
伊藤 慎一郎 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (50962114)
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2022-08-31 – 2024-03-31
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| Keywords | 幹細胞能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抜歯窩は常に膜内骨化で修復されるが、大腿骨円形骨欠損部は膜内骨化と軟骨内骨化が混在した治癒過程をたどると言われている。これまでに、骨再生過程における軟骨の出現に関しては、骨欠損部の骨安定性や血液供給、幹細胞の分化能などが注目されてきた。しかし、大腿骨円形骨欠損では骨周囲の環境、血液供給が十分にあっても軟骨が形成された点を踏まえると、骨化様式の差異は骨再生過程に出現する幹細胞の分化能に依存している可能性が大きいと考えた。そこで、本研究では骨格部位依存的に修復組織内幹細胞の分化能に多様性があるかを明らかにすることを目的とする。
8週齢の雄CAG-EGFP-Tg(GFP)マウスとRosa26-tdTomato(Tomato)マウスの左側上顎第一臼歯の抜歯と左側大腿骨骨幹部の円形骨欠損を作製した。損傷後3日目の抜歯窩と大腿骨骨欠損部から再生組織を採取し、各々を野生型マウスの抜歯窩及び大腿骨骨欠損部に異所性に移植した。移植後1週後、2週後に骨再生部を採取し、凍結切片を作製後、GFPまたはTomato陽性細胞の分布を解析した。また、同一の切片でALP染色、Sox9（軟骨関連マーカー）を免疫染色し、GFPマウスまたはTomatoマウス由来の軟骨細胞の存在を検討した。
その結果、抜歯窩再生組織を大腿骨骨欠損部へ異所性移植した場合、骨芽細胞への分化能は維持しているが、軟骨細胞への分化能は獲得していない可能性が考えられた。一方、大腿骨骨幹部円形骨欠損部再生組織の抜歯窩への異所性移植では、咀嚼等により移植組織が脱離したと考えられたので、現在、新たな移植法を検討中である。
今後は抜歯窩への異所性移植、およびBMP2を添加して異所性骨化誘導実験を行うことで、移植片の部位依存的な分化能の差異を明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GFPマウス抜歯窩組織の大腿骨骨欠損部への移植1週後では、GFP陽性細胞の多くはALP陽性細胞と類似した分布を示したが、GFPとSox9が共発現する細胞は確認できなかった。移植2週後では、再生骨の骨細胞に少数のGFP陽性細胞が確認できたが、Tomatoマウスの抜歯窩を移植した場合は再生骨にTomato陽性の骨細胞が確認できた。一方、大腿骨骨幹部円形骨欠損部再生組織の抜歯窩への異所性移植では、咀嚼等により移植組織が脱離したと考えられたので、現在、新たな移植法を検討中である。
抜歯窩再生組織を大腿骨骨欠損部へ異所性移植した場合、骨芽細胞への分化能は維持しているが、軟骨細胞への分化能は獲得していない可能性が考えられた。また、移植材料はGFPマウスよりTomatoマウスを使用した方が、移植後の経過を観察するのに適している可能性が示されたため、今後はTomatoマウスを使用して移植実験を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Tomatoマウスを用いて、異所性移植を行う予定のため、Tomatoマウスを繁殖中である。抜歯窩への移植後の移植片脱離防止については、移植片を留置した後、コラーゲンスポンジやゲル等の生体材料を使用して脱離防止を行う予定である。また、移植片にBMP2を添加し大腿部筋膜下へ移植し異所性骨化を誘導する実験を行う予定である。その結果により、骨格部位依存的に修復組織内幹細胞の分化能に多様性を示すことを目指している。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画より、本研究費は外部委託に使用する経費が多く占めている。しかし、試料検体となる遺伝子改変マウスの交配・繁殖に時間を要しているため、助成金の多くを使用することが困難である。消耗品（免疫蛍光染色・FACS使用に伴う試薬）約200,000円、委託費（遺伝子情報解析の委託）約800,000円（計画通りいけば秋頃執行予定）
次年度の5月頃、実験に使用する遺伝子改変マウスが繁殖する予定のため、実験に取り掛かる準備が可能と考える。そのため、次年度使用額が生じた。また、8月頃に遺伝子改変マウスの試料検体を回収し、遺伝子情報解析の外部委託を行う予定である。計画通りに進めば、12月以降に解析結果が得られ、発現する特定の遺伝子マーカーに着目して、機能解析を行う予定である。
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