2023 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of lipid regulation of neurotransmitter receptors using photo-sensitive amino acid
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22KF0249
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡村 康司 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80201987)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
ANDRIANI RIZKI 大阪大学, 大学院医学系研究科, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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| Keywords | 電位感受性ホスファターゼVSP / イオンチャンネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
cryo-electron microscopyで、ヒトGABA(A)Rチャネルの構造において、PIP2と結合することが報告されている複数のアミノ酸部位にHCKを導入し、前年度にP2Xと、Kir2.1チャネルをモデルケースとして確立した手法により電気生理学的計測およびUV照射実験をおこなった。その結果、HCKのuncagingにより、電流が増加する部位と、電流増加が見られない部位とがあることが明らかになった。この結果は、Ci-VSP（Ciona intestinalis voltage sensing phosphatase）を強制発現させたXenopus oocyteでの、two electrode voltage clampとmutagenesisによる、PIP2感受性の解析結果と合致するものであった。さらに、Ci-VSPを共発現させて、HCKのuncaging前後でのPIP2 depletionへの感受性を検証した結果、HCKのuncagingにより電流増加が見られる部位の場合には、UV照射前後でPIP2 depletionへの感受性が大きく変化することが確認できた。これらのことはGABA(A)Rが極めて強いPIP2結合特性をもち、PIP2のリン酸との結合に関わる単一アミノ酸の変異により、結合親和性が変化したことを示している。またこれらの結果から、GABA(A)RへのPIP2の結合が、チャネル機能に重要であることが初めて明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
これまでのVSPのみを用いた方法では明らかにできなかったイオンチャネル活性のPIP2感受性が、はじめて解明できたことになり、従来VSPによるPIP2 depletionでネガティブな結果であっても、PIP2感受性がないとは結論できないということが判明した。またcaged lysineとVSPを組み合わせた手法は、イオンチャネルのみならず膜タンパク質のPIP2感受性を検出する、従来なかった新規のツールキットとなることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後MD計算などと組み合わせて、各アミノ酸部位のPIP2結合における役割を明らかにするとともに、変異実験またはHCKのuncaging実験の結果の検証を行うことで、PIP2がどのようにチャネル活性を調節しているのかが明らかにできると考えられる。またPIP2の結合親和性が、各アミノ酸部位の変異によりどのように変化するかを生化学的に検証する必要があり、発現型細胞からタンパク質を精製し、カロリメトリーや native mass解析などによって、PIP2との結合を定量的に調べる計画である。さらに、これまで解析されたGABA(A)Rは特定のサブユニット構成のみであったが、他の組み合わせの場合にPIP2感受性がどのように多様であるのかを調べることで生理学的意義の理解に迫りたい。
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| Causes of Carryover |
今回PI(4,5)P2感受性が確認された部位が特異的な役割があるかどうかを確定するには、さまざまなアミノ酸を導入する実験を追加して行う必要がある。この実験をおこなうために、RNA合成試薬などの分子生物学実験試薬や動物飼育費などの支出が必要となった。
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