2021 Fiscal Year Annual Research Report
金属イオン修飾を利用した液-液相分離液滴の構造多型解析
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21J21141
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
川向 ほの香 北海道大学, 大学院総合化学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 液-液相分離 / アミロイド / NMR / SAXS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体分子の流動的な相互作用によって特定の分子が集合し、周囲から隔離された液滴領域が形成される「液-液相分離 (LLPS)」は、細胞内の転写制御おいて重要である一方、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの神経難病の発症との関連が示唆されている。天然変性領域を有するFused in sarcoma (FUS) は、このようなLLPSを示すタンパク質で、一定の濃度以上では自己会合して液滴を形成するものの、制御因子Kapβ2が結合することで液滴形成が抑制され、その平衡状態が制御されている。一方、ALS患者でみられるC9orf72遺伝子への繰り返し挿入配列から産生される(Pro-Arg)nポリジペプチド (PRn) 存在下では、このFUSの液滴内部にPRnが取り込まれることにより液滴が長時間安定に形成され、液滴内部でFUSが凝集し、アミロイド化する。つまり、PRnが存在することで、FUSの単分散と液滴の平衡を制御するKapβ2の機能が阻害されると想定される。
本研究では、制御因子Kapβ2とFUSの相互作用に対してPRnが与える影響について検討することで、PRnが細胞内のLLPS制御を破綻するメカニズムの解明を目指す。さらに、PRn存在下における細胞内でのFUSの動態を明らかにすることで、ALSの発症メカニズムの一端が明らかになると期待される。
昨年度は、PRによるKapβ2の機能阻害のメカニズムを明らかにするために核磁気共鳴 (NMR) 法などを用いた解析を行い，その成果の一部についてはNature Communicationsにて筆頭著者として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Kapβ2 に対するPRnの相互作用部位を明らかにするために、Kapβ2 に対するPRnのNMR測定を行った。その結果、PRnの添加に伴い、いくつかのKapβ2のNMR信号の強度とその化学シフトの変化が観測されたことから、PRnはKapβ2と相互作用することが示された。ここで信号強度と化学シフトの変化が観測されたNMR信号には、Kapβ2におけるFUSの認識結合部位である核局在化（NLS）部位のアミノ酸残基に由来する信号が含まれていたことから、PRnはKapβ2のNLS部位近傍にFUSと競合的に結合することで、FUSにおけるKapβ2のLLPS制御機構を破綻させることが示唆された。この結果をNature Communications にて筆頭著者として発表した。
また、Kapβ2によるFUSの相分離制御メカニズムをさらに検討するため、Kapβ2のPRnの結合部位を解明することで、Kapβ2がFUSを認識する際に重要なアミノ酸残基の同定を試みた。このようなアミノ酸残基の帰属を行うためには、高濃度のサンプルが必要であるが、これまでの手法では、Kapβ2の収量は必要量の半分以下であった。そこで、大腸菌のCodon最適化や培養条件や精製条件の検討を行った結果、NMR測定に十分な試料量を得ることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
FUSに金ナノ粒子を固定し、その金ナノ粒子に由来するSAXSを測定することによって、FUSの分子間または分子内における金ナノ粒子間の距離分布を求める。FUSにおける金ナノ粒子の固定箇所は、分子間や分子内の距離変化を追跡可能にするため、液滴を形成する際の起点であると考えられているN末端のLCドメイン内部と、LCドメインから離れたC末端を計画している。分子間の距離を測定するために、それぞれ1か所ずつに変異を導入した試料を作成し、分子内の距離測定用には、2か所に変異を導入した試料を作成する。このようなFUSへの変異がその構造に影響しないことは、NMRを用いて検討し、FUSと金ナノ粒子が結合したことはMALDI-TOFMSを測定することで確認する。SAXSの測定は高エネルギー加速器研究機構BL-10Cの利用を想定している。このビームラインはサイズ排除カラムクロマトグラフィーと接続されていることから、試料を分子量で分別でき、単分散の状態でのSAXS測定（SEC-SAXS）が可能で、そのX線照射による試料損傷も軽減できる。本年度はFUSにおける分子内および分子間の2点間距離分布の変化から、単分散状態や液滴状態におけるFUSの構造変化を明らかにすることを試みる。
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