ATPチャネルPannexinファミリーの構造機能解析

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J20692
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 田中 達基 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: クライオ電子顕微鏡 / ATPチャネル / 骨形成

Outline of Annual Research Achievements

Pannexin3に関して、哺乳細胞を用いた大量発現・Hisタグアフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを用いた精製に成功し、撮影試料を作製したのち200kVクライオ電子顕微鏡Talos arkticaを用いたデータ測定、解析ソフトRelionによるデータ解析によって膜貫通領域及び細胞内領域が明瞭に確認できる良好な二次元平均像が得られたことを以前に報告した。当該データセットを用いてさらに解析を進めたが、解析に用いることのできる状態の良い粒子の少なさから明瞭な三次元マップは得られなかった。そこでより多くのデータを取得するため撮影試料の再現を試みたが、Hisタグアフィニティー精製及びTEVプロテアーゼによるタグの切断が安定しないという問題から撮影試料作製には至らなかった。今年度はコンストラクトや発現ホストを再検討し、引き続き撮影試料の再現を目指す。またGFP-nanobodyを用いた精製法など精製プロトコルに関しても再検討し、より高純度かつ均一性の高い撮影試料を作製する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Pannexin3の安定性が芳しくなく、精製の再現が取れなかったため。

Strategy for Future Research Activity

コンストラクト及び精製法を検討しなおし、構造決定を目指す。