2021 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular basis of auditory amplification
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21J20958
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
二又 葉音 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 聴覚 / 膜タンパク質 / 分子モーター / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「聴覚シグナルの分子機構の解明」を目指し、タンパク質の構造解析実験を行っている。
我々が聴いた音は、聴覚器官を振動して内耳、聴神経へと伝わる。内耳には、届いた小さい音の振動を大きく増幅する仕組みがあり、聴覚の感度を100倍以上に高めている。この仕組みを担うのは「Prestinというモータータンパク質で、音に合わせて自発的に伸び縮みすることで、発現している外有毛細胞の共振を引き起こし、大きな振動へと発展させる。
このようなPrestinの分子伸縮と外有毛細胞の運動は聴覚感受の基盤であり、薬剤や加齢により聴障害を受けると難聴を引き起こす。しかし、その障害機構は未解明で、そもそもPrestinはどのような構造で、どの部位に活性化剤・阻害剤が作用するのか、その結果どのように構造が変化するのか、さらに構造変化がどのように外有毛細胞の伸縮を引き起こすのか、という根本的な機構 はほとんど謎のままである。
そこで本研究では、難聴の病態の理解を見据え、Prestinと外有毛細胞それぞれの構造をクライオ電子顕微鏡を用いて明らかにすることで、音に合わせた伸縮とその阻害機構を解明し、聴覚シグナル増幅機構の解明を目指す。
今年度はPrestinについて、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析によって構造解析をすることに成功した。構造解析にあたっては熱安定性変異を導入することによるタンパク質分子の安定化を行った。構造情報に基づいて機能解析を行い、Prestinの機能に重要性の高いアミノ酸残基を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
まずヒト由来 Prestinについて哺乳類細胞を用いた発現・精製を行ったが、 Prestinは 変性しやすく、急速凍結や電子線照射という過酷な条件での測定に耐えられなかった。そこで、Prestinにおいて種間に広く保存された配列に基づいて網羅的にアミノ酸変異導入を行ったところ、約10℃の熱安定性上昇に成功した。この試料について加速電圧300 kVクライオ電子顕微鏡Titan Kriosと直接電子検出器Gatan K3を用いて撮影を行い、画像解析を行った結果、分解能 3.4Åでの構造決定に成功した。Prestinは膜貫通ドメインと細胞内のSTASドメインという2つのドメインからなり、それらが互いに交差した2量体であることが明らかとなった。
構造情報に基づいて電気生理学的な機能解析を行ったところ、ドメイン相互作用に関わるアミノ酸残基の機能的重要性を確認した。こうした情報に基づき、Prestin分子の運動メカニズムを提唱した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、Prestinの塩化物イオン及びサリチル酸の結合状態について、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析に成功した。これらの構造はともに熱安定性変異を導入することで解析が可能になったもので、変異導入はタンパク質の安定化に有効であることが確認された。一方で、変異導入によってタンパク質の性質の一部が失われることが明らかになった。そこで、変異体と野生型を比較する機能解析実験を行うことで、分子機能の根幹を担う部位を特定し、より詳細な分子伸縮のメカニズムを明らかにする。
また、構造解析を行ったPrestinの状態はともに伸長した状態であった。収縮した状態の構造を明らかにするため、分子動力学シミュレーションを用いた再現を行う。現在予備的な実験として、陰イオン結合部位の近辺を中心にシミュレーションを行っており、この系を拡大した解析を試みる。さらに、Prestinの発現した外有毛細胞の電気生理学実験を行い、より生体に近い状態での機能解析を行うことで、聴覚器官などの高次のつながりを含むPrestinの働きを解明する。
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