2021 Fiscal Year Annual Research Report
真菌類の起源－最基部系統群アフェリダ、クリプト菌の比較ゲノム解析からのアプローチ
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21J01228
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Yokohama National University |
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Principal Investigator |
瀬戸 健介 横浜国立大学, 大学院環境情報研究院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 真菌類 / 寄生菌 / 進化 / 系統 / ゲノム解析 / ファイロゲノミクス / 比較ゲノム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、真菌類の最基部系統群であるアフェリダ門、クリプト菌門のゲノム・発現解析により、真菌類の起源および初期進化を解明することを目的としている。本年度は、（1）藻類寄生性菌類アフェリダの新規培養株の確立およびその分類学的検討、（2）ゲノムシーケンスに向けたDNAサンプルの調製、（3）ゲノム解析環境の整備および予備解析を行った。
（1）では、セレナスツルム科緑藻寄生性アフェリダKS114株について、形態観察および分子系統解析の結果に基づく新種記載の論文を投稿し受理された。また、新たに確立されたイカダモ科緑藻寄生性アフェリダKS120株について検討し、既知種Amoeboaphelidium occidentaleと同定された。（2）では、KS114株については、まずはバクテリアフリー株の確立を試み、成功した。大量培養の条件を検討したため、次年度にDNA抽出およびゲノムシーケンスを行う予定である。KS120株については、宿主のゲノムが入手可能であるため、分離は行わずにDNA・RNA抽出を行った。現在、本株のゲノムシーケンス解析が進行中である。また、培養株を確立できなかったアフェリダやクリプト菌について、細胞の単離および全ゲノム増幅を行い、シングルセルゲノム解析を進めた。（3）では、解析用PCを購入しゲノム解析環境を整備し、上述のシングルセルゲノム解析のデータについて予備解析を行った。メタゲノムビニングによるコンタミネーションの除去を行った結果、一部のアフェリダ、クリプト菌で一定以上のクオリティのゲノムアッセンブルが得られた。また、予備的なファイロゲノミクス解析を行い、それぞれの系統的位置を確かめることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下の通り、本年度の３つの目標を概ね達成できたと判断した。
（1）藻類寄生性菌類アフェリダの新規培養株の確立およびその分類学的検討：2培養株について、その分類学的検討を進めることができた。受入先研究室にて維持されていたセレナスツルム科緑藻寄生性アフェリダKS114株について、形態観察および分子系統解析の結果に基づく新種記載の論文を投稿し受理された。2021年4月から10月にかけて滞在したミシガン大学（米国）にて確立したイカダモ科緑藻寄生性アフェリダの培養株KS120株について、形態観察および分子系統解析に基づき、既知種Amoeboaphelidium occidentaleと同定できた。
（2）ゲノムシーケンスに向けたDNAサンプルの調製：KS114株のDNA抽出の事前準備およびKS120株のDNA・RNA抽出に加え、培養することができなかったアフェリダおよびクリプト菌について、シングルセル解析の試料準備を進めることができた。KS114株については、バクテリアフリー株の確立に成功し、ゲノム抽出用の培養条件も検討することができた。KS120株については、宿主のゲノムデータが入手可能であるため、分離を行わずにDNA・RNA抽出を行い良好なサンプルを得た。シングルセル解析用のサンプルについては、複数種の細胞を単離し、全ゲノム増幅を行った。
（3）ゲノム解析環境の整備および予備解析：新規に購入した解析用PCの解析環境の整備および一部データの予備解析を進めることができた。上述のシングルセル解析のデータの予備解析を行った。メタゲノムビニングによるコンタミネーションの除去を行い、一部のアフェリダ、クリプト菌で一定以上のクオリティのゲノムアッセンブルを得ることができた。これらのゲノムアッセンブルデータを用いた予備的なファイロゲノミクス解析を行い、それぞれの菌の系統的位置を確かめることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、アフェリダの培養株のde novo ゲノム解析を進める。新規アフェリダKS114株については、本年度に確立したバクテリアフリー株を用い、アフェリダと宿主藻類の分画を行った上でDNA抽出を行い、外注サービスを利用して全ゲノムシーケンスを行う。Amoeboaphelidium occidentale KS120株については、進行中のゲノムシーケンスが終わり次第データの解析を進める。近縁な分類群であるクリプト菌類やツボカビ類でゲノムの倍数性が報告されており、アフェリダ類でも同様のケースが予想されるため、ゲノムアッセンブルの方法についても検討する予定である。アフェリダ類およびクリプト菌類のシングルセルゲノム解析のデータについては、予備的なメタゲノムビニングのブラッシュアップを行い、最終的なゲノムアッセンブルを完成させる。以上の解析で得られるゲノムアッセンブルデータを用いて遺伝子予測、機能アノテーションを行う。特にアフェリダ類は過去にゲノム解析の例がない系統群であるため、遺伝子予測の手法の検討を行う。
上記のde novoゲノム解析と並行して、ファイロゲノミクス解析のタクソンサンプリングおよびマーカー遺伝子選択の検討を進める。マーカー遺伝子については、既存の真菌類用および真核生物用のデータセットを検討し、アフェリダ類およびクリプト菌類に最適なデータセットを選択する。最終的に、各アフェリダ類、クリプト菌類のゲノムの遺伝子予測によって得られたプロテオームデータを用いてデータセットを完成させ、最尤法およびベイズ法による系統解析を行う。
また、翌年度に行う予定のアフェリダのトランスクリプトーム解析のためのRNA抽出も進める。新規アフェリダKS114株を用いる予定で、生育段階ごとのサンプルを得るための同調培養方法について検討する。
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