2022 Fiscal Year Annual Research Report
ペプチド核酸による二本鎖ＤＮＡ認識の構造学的解析と遺伝子工学応用
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22J14529
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柴田 将成 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2022-04-22 – 2024-03-31
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| Keywords | DNA / PNA / ペプチド核酸 / インベージョン / 結晶構造解析 / ヌクレオソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ペプチド核酸（PNA）は「インベージョン」と呼ばれる二本鎖DNAとの特徴的な結合様式が可能であり、生体内での二本鎖DNAの配列選択的な認識技術として応用が期待されている。本申請課題では、これまで詳細な立体構造が解明されていないインベージョン複合体について構造学的な分析に取り組み、二本鎖DNAを制御する基盤技術への展開を目指す。
本年度はインベージョン複合体のX線結晶構造解析に取り組んだ。研究開始当初に設計したインベージョン複合体で得た結晶は安定性が低く、結晶化までに時間を要したためサンプルの再設計を行った。二本鎖DNAおよびPNAの鎖長をそれぞれ短縮し、さらにPNA/DNAの2か所の相補領域を同一の塩基配列として簡略化を行うことで、サンプル調製から結晶化スクリーニングまでの工程を迅速化した。また、測定条件において安定な結晶を得ることに成功した。
また、インベージョン複合体の部分構造となるPNA/DNA二本鎖のX線結晶構造解析に取り組んだ。多波長異常散乱法での解析のため、チミン塩基と同様の塩基対形成が可能かつ、臭素原子を有するウラシル塩基誘導体を原料としてPNAモノマーを合成した。これを用いた固相合成により、PNAオリゴマーの合成、精製まで完了し、結晶化スクリーニングに取り組んでいる。
真核生物の生体内のDNA のモデルとして、ヒストンタンパク質とDNA を人工的に複合化した再構成ヌクレオソームを標的とし、PNAによるインベージョンが可能か検証した。ヒストンタンパク質と二本鎖DNAが相互作用する複数の領域を標的として、蛍光標識PNAを合成した。ゲル電気泳動によって複合体の形成を評価した結果、ヒストンタンパク質と複合化していない二本鎖DNAに対してはインベージョン複合体が形成した一方で、ヌクレオソームに対しては複合体の形成がみられず、全く異なる挙動を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時の研究実施計画では、インベージョン複合体のX線結晶構造解析およびヌクレオソームへのインベージョン実験の初期検討を目標とした。
申請者はインベージョン複合体を構成する二本鎖DNAおよびPNAの塩基配列、鎖長、塩基対形成時に相補となる領域を設計することによりインベージョン複合体の結晶化までの工程を大幅に簡略化し、測定条件で安定な結晶を得た。
また、多波長異常散乱法での解析に利用可能なPNAオリゴマー合成に成功し、インベージョン複合体の部分構造となるPNA/DNA二本鎖の結晶化も同時に遂行した。
さらにヌクレオソームを標的としたインベージョンの初期検討を行い、二本鎖DNAとは異なる挙動を示す知見が得られた。
以上の結果から、目標達成、もしくは目途がたっている状況であり、当該申請課題はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きインベージョン複合体およびPNA/DNA二本鎖の結晶構造解析を行う。重原子を導入したPNAを用いることで多波長異常分散法によってインベージョン複合体の立体構造を明らかにする。得られた構造情報をもとに分子動力学シミュレーションを行い、インベージョン複合体中のDNAと結合したPNAの挙動を明らかにし、機能性分子を合理的にPNAへと連結する指針を見出す。
再構成ヌクレオソームに対するPNAによるインベージョン実験については、昨年度に得られた知見からヒストンタンパク質と二本鎖DNAが接近している領域以外に、二本鎖DNAの自由度が高い領域を新たに標的とし、PNAが安定にヌクレオソームと結合可能な範囲を調査する。
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