2021 Fiscal Year Annual Research Report
哺乳動物FoF1ATP合成酵素全体の構造解析によるエネルギー変換の原子機構解明
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20J40167
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
慈幸 千真理 京都大学, 複合原子力科学研究所, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ATP合成酵素 / ミトコンドリア / 膜蛋白質複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、哺乳動物ミトコンドリアのFoF1ATP合成酵素四量体(tetramer)全体を安定化させ、その機能する全長を高分解能X線結晶構造解析すること、さらには、クライオ電子顕微鏡（クライオ電顕）を用い、単粒子静的構造解析及び溶液中の本酵素の経時変化（動的立体構造）を明らかにし、本酵素の働きについて、詳細なメカニズムを解明することを目的とする。この四量体での試料調製は実現できれば世界初であると同時に、解析に値する安定したサンプルを大量に作製するために必須のものであると考えている。申請者は、蛋白質に負荷をかけないカラムフリー精製に取り組んだ結果、安定で無傷な本酵素四量体を精製することに成功したため、構造解析のステップに入る準備を行った。しかしながら、カラムフリー精製に用いたショ糖を除去する段階で、白濁沈殿を起こすことと膜蛋白質複合体で見られる濃縮膜による濃縮ができないという課題を解決する必要があった。そこで、申請者は、まず本酵素単量体が無傷で安定なまま溶液交換と濃縮を同時に行える方法を開発した。四量体については、単量体と同様の条件では不安定になったため、条件を最適化している段階である。
本酵素四量体ではないが単量体もまた高分解能構造解析を行う価値があると考えた。なぜなら、哺乳動物の本酵素は不安定で精製が困難なため、原子レベルでの全体構造はまだ解明されていないからである。よってクライオ電顕を用いた構造解析を共同研究で行うため、資料提供を行っている。またX線回折実験に必要な三次元結晶化に向けた幅広いスクリーニングを行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本酵素四量体の構造解析用試料調製はまだ完了していないが、単量体については、構造解析のステップに入っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
FoF1ATP 合成酵素四量体全長の精製を継続し、安定で無傷な精製標品を得る。申請時には予想していなかった、ショ糖の除去や濃縮の課題を解決する。次に沈殿剤による幅広い条件の三次元結晶化スクリーニングを行う。本酵素が安定に存在し、かつ結晶となり得る結晶化温度の検討、沈殿剤の種類・濃度、塩の種類・濃度、pH等の検討を行う。また結晶品質の向上には、添加物の検討、沈殿剤の濃度の最適化等を行う。結晶化→結晶凍結→X線回折実験のサイクルを回し、結晶化およびクライオ条件の最適化を行い、質の高い結晶を作製し、3.0オングストローム分解能を超えるX線回折データから、高精度な原子モデルを決定する。
またクライオ電顕を用いた構造解析は共同研究で行うため、クライオグリッド作製に最適な試料を調製し提供を行う。
なお、ウシの心臓から得られる本酵素だけでなく、ヒト由来培養細胞から得られる本酵素も精製し、ヒト酵素の精製純度、収量を上げる精製方法の改善に取り組む。
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