2021 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of antisense long non-coding RNA SUF mediated regulation of sexual differentiation in the bryophytes
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21J22429
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
梶原 智明 京都大学, 生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 長鎖非翻訳RNA / アンチセンスRNA / エピジェネティック制御 / 性分化 / 有性生殖 / ゼニゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コケ植物苔類に属するゼニゴケは雌雄異株の半数体植物である。鍵因子BNBの働きにより生殖系列細胞が分化した後、常染色体上のメス化因子FGMYBと、その逆鎖からオス特異的に転写されFGMYBをcisに発現抑制する長鎖非翻訳RNA SUFが雌雄の分化を切り替える。本研究は、FGMYB/SUFモジュールを中心とするゼニゴケの性分化制御を遺伝子発現およびクロマチン制御の観点から解析し、長鎖非翻訳RNAを介した生殖系列細胞の性分化制御機構を解明することを目的とする。
本年度は、生殖細胞のクロマチン構造を解析するため、セルソーター（FACS）を用いてゼニゴケ核を単離する実験系、また蛍光標識した核のみを単離する系を確立した。しかし、発生初期の生殖系列細胞を蛍光標識したBNB-Citrine株（Yamaoka et al. 2018）を用いて始原生殖細胞の核単離を試みたところ、細胞集団の割合が極めて少なく、クロマチン解析に必要な核数を回収することが困難であることが判明した。
そこで方針を一部変更し、生殖細胞分化の鍵因子BNBを異所的に誘導発現することで、大量の生殖細胞を形成する植物体を作出し、解析に用いることを考えた。ゼニゴケ用のCRISPR activation（CRISPRa）遺伝子活性化システムを新規に開発し、XVE誘導発現系に組み込むことで、エストロゲンの添加により目的の遺伝子を誘導過剰発現する系を構築した。BNBを栄養組織から異所的に発現誘導すると、栄養成長が停止し、メリステム領域から生殖系列細胞様の細胞が大量に形成された。次年度以降は、この系を用いて分子機構の解析に取り組む。
また、当研究室で新規に同定されたゼニゴケの性決定因子BPCUとFGMYB/SUFモジュールの関係を解析し、研究成果を国際学術誌に報告した（Iwasaki, Kajiwara et al. 2021）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
FACSを用いてDAPI蛍光に基づきゼニゴケの細胞核を単離する実験系を確立した。また、蛍光標識した細胞核を単離・濃縮する系を確立した。生殖細胞核で特異的に蛍光タンパク質を発現する植物体を利用することで、生殖細胞の核のみを単離し、遺伝子発現やクロマチン構造を解析することが可能になった。
しかし、BNB-Citrine株（Yamaoka et al. 2018）を用いて、生殖系列細胞の性分化パターンが決定すると考えられる始原生殖細胞の核単離を試みたが、細胞の希少性から解析に十分な個数の核を集めることが予想外に困難であることが判明した。そこで、ゼニゴケ用のCRISPRa遺伝子活性化システムを新規に開発し、生殖細胞分化の鍵因子BNBを内在性の遺伝子座から異所性発現することで、生殖系列細胞様の細胞を大量に形成する植物体を作出した。この生殖系列細胞様細胞の分化誘導系を利用することで、生殖系列細胞分化と性分化制御の分子機構を高解像度に解析できることが期待されるが、今年度予定していた実験が次年度以降に延期されたため、（３）やや遅れている。と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下について重点的に行う。
・BNBの異所性発現による生殖系列細胞様細胞の分化誘導系を用いてトランスクリプトーム解析を行い、既知遺伝子の発現から、本実験系で野生株と同様の性分化制御が働いているかを評価する。
・同誘導系を用いて、大量に形成される始原生殖細胞の核をFACSで単離し、NGS解析により遺伝子発現およびクロマチン構造を明らかにする。
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