ヒト多能性幹細胞が有する分化指向性に基づいた血球分化メカニズム解明

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J40090
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 北川 瑶子 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: 血球分化 / iPS細胞 / SNP

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、複数ドナー由来ヒトiPS細胞を用いて胎児期血球細胞分化を行い、分化効率の個人差から血球分化に必要な転写・エピゲノム制御機構の解明を行う。昨年度までの研究により、白血球数の少ないドナー由来iPS細胞からは血球前駆細胞分化の量や質が低く、iPS細胞由来血球分化においてドナー白血球数の決定要因の一部が再現できている可能性が示唆された。また、血球分化能が高いクローンと低いクローンで、血球前駆細胞の転写エピゲノム制御に違いがあることが明らかになった。本年度は、この違いに寄与する制御因子を同定するため、分化過程で差のある分子を抽出し、機能検証を行なった。

機能解析の対象とする因子は、血球分化能が高い群と低い群を比較した際に、血球前駆細胞で発現の低い遺伝子に限定した。また、直接的に遺伝的要素があるものを優先するため、iPS細胞ドナーのSNPアレイの結果を用いて、血球分化能が高い群と低い群で差のあるSNPが存在する因子を抽出した。さらに、ドナー白血球数とSNPデータの存在するおよそ100検体について、SNPのジェノタイプと白血球数に関連があるかを調べた。

次に、これらの候補因子を分化能が高いクローンでCRISPR-Cas9を用いて欠損させ、血球分化への影響を解析した。その結果、ある因子をヘテロ欠損させると血球前駆細胞における血球特異的遺伝子の発現誘導が十分に起こらないことが明らかになった。現在複数のクローンでヘテロ欠損株を作製し、再現性を確認しているところである。これらの結果をもとに、今後この因子の機能メカニズムを明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究目標は、血球分化能の高いクローンと低いクローンの違いを転写エピゲノムレベルで明らかにし、SNPアレイの結果と照合して個人差に関与する遺伝的要因を調べることであった。また、その結果から分化能に影響を与える制御因子候補を挙げ、次年度に機能解析を行う予定であった。本年度の研究成果として、予定通り分化能と相関する転写エピゲノム制御およびSNPをバイオインフォマティクス解析により同定した。個人差に関与するSNPの機能解析には至っていない一方で、その上流制御因子の機能解析を開始し、分化能に影響を与える可能性が高い因子を見つけることができた。来年度にこの現象の再現性を確認し、因子のゲノム領域周辺のSNPの機能検証を行うことで、本研究課題の目標が達成されると考えている。したがって、本研究は順調に進展していると評価した。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究成果により、血球分化能の高いクローンと低いクローンの分子制御に影響を及ぼす制御因子の候補が挙がった。この結果に基づき、来年度は機能解析により差が出ている因子に注目し、分化能の高い複数のクローンでヘテロ欠損株を作製しその影響を調べる。また、その分子メカニズムを明らかにするため、分化過程の転写エピゲノム制御を解析する。

並行して、血球分化における個人差に寄与する遺伝的要因を明らかにするため、この因子付近のSNPで、血球分化能と相関するジェノタイプを示すものを探索し、その機能検証を行う。具体的には該当SNPを分化能の高いクローンに導入、および分化能の低いクローンのSNPを修復することで、近傍遺伝子の発現への影響を明らかにする。

これらの研究を通して、複数ドナー由来iPS細胞を用いることで血球分化に重要な因子および分子制御が同定できることを示すとともに、個人の白血球数の違いの遺伝的要因解明に貢献できると期待される。