2021 Fiscal Year Annual Research Report
皮膚レジデントメモリーT細胞の発現分子が乾癬病態形成に及ぼす影響の検討
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21J20907
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
久米 美輝 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 皮膚レジデントメモリーT細胞 / SEMA4A / 尋常性乾癬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、Th17の免疫応答を制御するSEMA4Aを欠損したマウス（SEMA4A欠損マウス）と野生型マウスにおいて、マウス乾癬様皮疹誘発モデル、マウス接触皮膚炎誘発モデルを使用し、乾癬における皮膚レジデントメモリーT細胞（TRM）とSEMA4Aの関わりを検討している。SEMA4A欠損マウスにおけるこれらのモデルでの応答性が微細な条件の相違によって異なることが分かってきた。さらに、疾患モデルを生じる前のnaiveな状態において、SEMA4A欠損マウスでは既に表皮内・真皮内浸潤T細胞数が多いこと、特にレジデントメモリーマーカー陽性T細胞が増えていることをflow cytometryで確認し、病理結果からは表皮肥厚傾向がみられることが判明した。免疫染色の結果からも皮膚内T細胞浸潤が増えていることを確認しており、今後はこの細胞の分画、サイトカイン産生能などの機能を明らかにしていく予定である。また、SEMA4Aは、樹状細胞などをはじめとした免疫担当細胞での発現が知られているが、単離ケラチノサイトのqPCR結果から、ケラチノサイトもSEMA4Aを発現していることを確認した。ケラチノサイトのSEMA4Aの発現の有無が、表皮肥厚、皮膚内細胞浸潤、特にTRM構築に寄与している可能性、さらに、TRMの機能に寄与している可能性について、今後マウスモデルやin vitroでの細胞刺激、細胞共培養試験などを通して検討を進める予定である。さらに、樹状細胞や、そのほかの免疫担当細胞での機能の変化が無いかを確認する予定である。
また、尋常性乾癬や円形脱毛症、皮膚リンパ腫といったヒトの様々な疾患でも皮膚TRMの評価をflow cytometry や組織染色などで行い、データを蓄積して疾患ごとの特性を見出す所存である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者は、SEMA4A欠損マウスと野生型マウスにおいて、イミキモド（IMQ）を使用するマウス乾癬様皮疹誘発モデル、DNFBを使用するマウス接触皮膚炎誘発モデルを使用し、乾癬における皮膚レジデントメモリーT細胞（TRM）とSEMA4Aの関わりの検討を開始した。flow cytometry での解析から行うこととしたが、実験開始後しばらくは皮膚内T細胞を十分量flow cytmetoryで確認するための処理方法や細胞染色時の抗体濃度の検討することに時間を要した。
また、Th17傾向のある多発性硬化症の患者で特に血清中のSEMA4Aが上昇していることが知られいるため、マウス乾癬様皮疹誘発モデルではSEMA4A欠損マウスの耳介厚腫脹が低下するのではと予想していた。一方、Th1細胞がSEMA4Aを発現していることから、SEMA4A欠損マウスでは野生型マウスと比較し耳介厚腫脹が低下するのではと予想していた。しかし、両モデルにおいて微細な条件の変化で耳介腫脹が変動することが明らかとなり、乾癬様皮疹誘発モデル作成時のIMQの外用量を変更したり、接触皮膚炎誘発モデル作成時のDNFBの濃度を詳細に検討したりするなどして2021年度前半は進捗状況に遅れが生じた。
しかし、naive な耳での耳介厚がSEMA4A欠損マウスで野生型よりも厚いこと、flow cytometry にて接触皮膚炎モデル作成後のSEMA4A欠損マウスの耳に細胞浸潤が明らかに多かったことから、まずはnaive な耳の解析を進めることとした。現在、SEMA4A欠損マウスにおいてnaive な耳の表皮・真皮肥厚していること、naive な状態で皮膚内T細胞浸潤が多いことが判明した。実験当初に予期していた方向性とは異なるが、SEMA4Aが皮膚免疫において重要な役割を果たしていると考えるに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
表皮・真皮ともにSEMA4A欠損マウスで野生型マウスと比較しT細胞浸潤数が増加していることが分かったため、今後はこれらがgdT細胞・CD4陽性T細胞・CD8陽性T細胞のいずれにあたるのかを検討する予定である。もしgdT細胞が増えていた場合には、それらがVg3陽性細胞なのか、IL17A産生能があると報告されているVg4 陽性細胞なのか、といったところを細かく確認し、それらの細胞のサイトカイン産生を確認予定である。サイトカイン産生能に変化があれば、マウスから単離したリンパ球をTh17 skewing な環境下で培養し、野生型とSEMA4A欠損マウスのリンパ球でTh17への分化の違いが見られないかを確認したい。
次に、SEMA4A欠損マウスにおいて皮膚浸潤T細胞が増えている理由を調べるため、皮膚内のサイトカイン量や、ケラチノサイト等からのCCL20の産生、T細胞のCCR6の発現を確認したいと考えている。
また、ケラチノサイトがSEMA4Aを発現していることが分かったが、SEMA4Aの有無によりケラチノサイトの抗菌ペプチドやサイトカイン、ケモカインの産生量といった機能がどのように変化するのかをqPCRにより確認する予定である。SEMA4Aは受容体を介してシグナルと細胞内に伝えるため、ケラチノサイトにどういったSEMA4A受容体が発現しているかも確認し、flow cytometryやウエスタンブロットによりシグナル伝達機構についても解明したいと考えている。
さらに、ケラチノサイトやT細胞に限らず、皮膚中のマクロファージや樹状細胞におけるSEMA4Aの発現を確認し、それらの免疫担当細胞が発現するSEMA4Aがどのように皮膚内環境に影響するのかをマウスモデルや細胞共培養試験などのvitro 実験を用いて解明したいと考えている。
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