2021 Fiscal Year Annual Research Report
基部陸上植物ゼニゴケの胞子をモデルとした単細胞における不等分裂メカニズムの研究
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21J40092
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
坂本 友希 神戸大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物 / 非対称分裂 / 細胞骨格 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、陸上植物進化の基部に位置する苔類ゼニゴケをモデルに、単細胞での細胞自律的な不等分裂の分子機構を解明することを最終目的とする。申請者は、ゼニゴケの個体発生開始点である胞子で不等分裂に先立って核が細胞中央から辺縁部へと細胞骨格依存的に移動することを見出していた。さらに、胞子における予備的なRNAseq解析からゼニゴケに唯一の低分子量GTPaseであるMpROPの関与が示唆されたことから、胞子の不等分裂におけるMpROPの分子機能を明らかにすることにした。本年度の実績は以下である。
【胞子の不等分裂における核の移動】胞子の不等分裂に先立って核が移動する現象について経時的な定量解析を行い、論文として発表した。
【MpROP遺伝子の発現抑制】 MpROP遺伝子の機能欠損は致死となり解析できない。この問題を解決するため一過的な発現抑制を試みた。エストロゲン誘導性プロモーター(proE2F::XVE)の制御下で人工マイクロRNA(amiRNA)を発現させる系を確立した。人工遺伝子合成により作出したゼニゴケマイクロRNA遺伝子(MpmiR160)の骨格を持つベクターに、標的配列に即して設計した短い合成オリゴを挿入する方法を考案し、さまざまな標的配列に対して容易にamiRNAの発現プラスミドを作出できるように工夫した。
【MpROP遺伝子の過剰発現】 エストロゲン誘導性プロモーターの制御下で野生型MpROPおよび恒常活性型MpROP-G15Vを一過的に過剰発現する形質転換体を作出した。これらの形質転換体はエストロゲンを含む選択培地上でMpROPGAP機能欠損株と同様の表現型を示し、機能的なMpROPタンパク質を誘導的に発現できていることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・胞子の不等分裂に先立って核が移動することを定量的に示すことができ、国際誌に論文を発表した。
・MpROP遺伝子はゼニゴケゲノムに唯一の低分子量GTPaseであり、その機能欠損は致死となって解析できない。従って、一過的な発現抑制系の確立が本研究計画の最も重要な課題であった。本年度はこの課題をクリアすることができた。
・これまでのライブイメージング解析では、微小管のみを可視化した株を用いており、得られる情報が限定的であった。そこで、微小管/核、アクチン/核、微小管/アクチンの同時可視化株の作出を進めた。同一のプロモーターの制御下で複数の遺伝子を発現できるポリシストロニックな発現系を用いた同時可視化株の作出に成功した。
・ゼニゴケの組織透明化技術の開発に貢献したMpRSL1プロモーターレポーター株の胞子を用いたイメージングを行った。その結果、仮根形成のマスターレギュレーターであるMpRSL1の発現が分裂前の胞子においてすでにみられることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
【MpROP遺伝子の一過的発現抑制および過剰発現の影響】 エストロゲン誘導性プロモーター(proE2F::XVE)の制御下で、人工マイクロRNA(amiRNA)により一過的にMpROPの発現を抑制した株および野生型MpROP・恒常活性型MpROP-G15Vを一過的に過剰発現した株と、微小管・核・アクチンの可視化株との掛け合わせにより胞子を得る。これらの胞子を用いて不等分裂過程のライブイメージングを行い、MpROPの発現抑制あるいは過剰発現の影響を明らかにする。
【MpROPの細胞内局在解析】 蛍光タンパク質を結合したMpROPにより胞子におけるMpROPの局在を解析する。MpROPの活性化部位を明らかにするため、ROPエフェクターのROP結合ドメインを利用して解析を行う。
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