2022 Fiscal Year Annual Research Report
基部陸上植物ゼニゴケの胞子をモデルとした単細胞における不等分裂メカニズムの研究
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21J40092
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
酒井 友希 神戸大学, 理学研究科, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 植物 / 非対称分裂 / 細胞骨格 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、陸上植物進化の基部に位置する苔類ゼニゴケをモデルに、植物の単細胞における細胞自律的な不等分裂の分子メカニズムを解明することを最終目的とする。申請者は、ゼニゴケの個体発生開始点である胞子で不等分裂に先立って核が細胞中央から辺縁部へと細胞骨格依存的に移動することを見出した。胞子における遺伝子発現プロファイルからゼニゴケに唯一の低分子量GTPaseであるMpROPの関与が示唆されたことから「活性化されたMpROPが胞子の細胞膜にドメインを形成し、細胞骨格と相互作用することによって細胞極性を形成し、核を移動させる」という仮説を立てた。本仮説を検証するため、エストロゲン誘導系を用いた一過的なMpROPの発現抑制及び過剰発現の影響を調べることにした。
昨年度に作出したエストロゲン誘導性プロモーター(proE2F::XVE)の制御下でMpROP遺伝子をターゲットにした人工マイクロRNA(amiRNA)を発現する形質転換体を用いて、今年度新たに作出した微小管/アクチン/核の可視化株との交配により胞子を取得した。次に、一過的なMpROPの過剰発現の影響を調べるため、エストロゲン誘導性プロモーターの制御下でMpROP、恒常活性型MpROP G15Vおよびドミナントネガティブ型MpROP T20Nを過剰発現する形質転換体と微小管/アクチン/核の可視化株との交配により胞子を取得した。これらの胞子をエストラジオール含有培地で培養したところ、ドミナントネガティブ型MpROP T20N過剰発現株を含む一部の胞子で発芽が異常となり、胞子発芽においてMpROPが機能することが明らかとなった。
本年度は、国内の学会および研究会で発表することで議論を深めた。また、ゼニゴケにおいて２種類のマーカータンパク質をバイシストロニックに発現させる系を確立し、日本語の記事として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
・前年度に作出したゼニゴケゲノムに唯一の低分子量GTPaseであるMpROP遺伝子の一過的な発現抑制株と、同一のプロモーターの制御下で複数の遺伝子を発現できるポリシストロニックな発現系を用いた微小管/核、アクチン/核、微小管/アクチンの同時可視化株とを交配し、F1胞子を取得した。さらにF1胞子の中から、発現抑制系と細胞骨格可視化系の両方を持つ雌雄の系統を選抜し、それらを交配してF2胞子を取得した。F2胞子は全ての個体が発現抑制系と細胞骨格可視化系の両方を持つため、定量的な解析が可能となった。
・誘導的に野生型MpROP、恒常活性型MpROP、ドミナントネガティブ型MpROPを発現できる形質転換株と上記の細胞骨格可視化株から交配によりF1胞子を取得した。これらの胞子では胞子発芽が異常となったことから、胞子発芽においてMpROPが機能することが明らかとなった。
・活性化型ROPの細胞内局在を明らかにするため、シロイヌナズナのROPエフェクターであるMIDD1のC末端領域に蛍光タンパク質を付加して誘導的に発現させる形質転換株を作出した。この形質転換体ではMpROPが機能すると考えられる先端成長領域に蛍光タンパク質の局在がみられた。この形質転換体を交配に用いて胞子を取得できた。
・「先進ゲノム支援」の支援課題に採択され、ゼニゴケ胞子におけるシングルセルRNAseq解析に挑戦した。細胞サイズの問題から予備的な結果となったが、MpROPを含め発芽を誘導した胞子で高発現している遺伝子群が明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
【MpROP 遺伝子の発現抑制・過剰発現が胞子の不等分裂におよぼす影響の解明】
エストロゲン誘導性プロモーターを利用して時期を限定して遺伝子の高発現を誘導できる系を用いて、胞子の発芽誘導時にMpROP遺伝子を発現抑制・過剰発現して解析する。まず、エストロゲン誘導性プロモーター(proE2F::XVE)の制御下でMpRop 遺伝子をターゲットにした人工マイクロRNA を発現する形質転換体を作出し、微小管/アクチン/核の可視化株と交配して胞子を取得した。エストロゲン(β-estradiol)を含む選択培地上で培養して不等分裂を誘導し、細胞骨格と核の動態を経時的に観察する。次に、エストロゲン誘導系を利用してMpROPあるいは恒常活性型MpROP_G15Vを胞子で一過的に過剰発現する形質転換体と微小管/アクチン/核の可視化株との交配により取得した胞子を用いて、MpROP過剰発現が細胞骨格と核の動態に及ぼす影響を解析する。
【不等分裂過程でのMpROPの活性化領域の解明】
MpROP 遺伝子自身のプロモーターの制御下で、蛍光タンパク質を結合したMpROP（Citrine-MpROP、tdTomato-MpROP）を発現させた形質転換体と微小管/アクチン/核の可視化株との交配により取得した胞子を用いて、不等分裂過程でのMpROPの局在変化を経時的に解析する。次に、シロイヌナズナのROPエフェクターの活性型ROP結合ドメインに蛍光タンパク質を結合したタンパク質を発現した形質転換体と微小管/アクチン/核と同時可視化した胞子を用いて、不等分裂過程でのMpROPの活性化領域と細胞骨格の動態を経時的に解析する。また、アクチン繊維の重合阻害剤、微小管の重合阻害剤を処理し、MpROP の細胞内局在と活性化領域に及ぼす影響を検証する。
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