培養細胞発現系に代わる昆虫の味覚受容体―リガンド解析系の構築

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J00931
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 高井 嘉樹 広島大学, 統合生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: 味覚受容体 / 産卵選好性 / 宿主選択 / カイコガ科の進化 / 化学感覚子

Outline of Annual Research Achievements

当初の目標としては、クワコ（鱗翅目）と寄生バエ（双翅目）について、肢の化学受容体の機能解析を進める予定であったが、採集した寄生バエのコロニー樹立が難しいことから、クワコを用いた「昆虫の味覚受容体―リガンド解析系の構築」に着手した。
当初の計画通り、クワコの成虫肢（第5附節）を用いてRNA-seqを行い、味覚受容体の候補遺伝子をリストアップした。なおバイオインフォマティクス解析は、学習院大学の嶋田透教授・李允求助教との共同研究として行った。RNA-seqの結果、味覚受容体候補遺伝子として23遺伝子を見出した。産卵に寄与する味覚受容体遺伝子は、雄成虫よりも雌成虫の発現量が多いと予想される。定量PCRによる解析の結果、9遺伝子が、雄成虫よりも雌成虫において発現量が顕著に多いことが明らかになった。続いて、これらの遺伝子の機能解析を進めるために、ショウジョウバエ口吻で安定的・機能的に遺伝子を発現させる系の確立に着手した。遺伝子組み換え技術を利用して、現在までに、5遺伝子についてトランスジェニック系統の作製に成功している。また樹立したトランスジェニック系統の中から、桑葉の抽出物に応答する（摂食行動を示す）系統を見出すことに成功した。なお野生型のショウジョウバエは、桑葉抽出物に対して摂食行動（吻伸長）を示さないため、摂食行動を示した遺伝子組換え系統に導入されたトランスジーンが、桑の分子を認識する味覚受容体である可能性が高い。加えてクワコ雌成虫の産卵選好性にも寄与している可能性が出てくる。また、トランスジェニック系統の作製と並行して、電気生理学的実験装置の立ち上げを行った。これまでにショウジョウバエ唇弁の感覚子から、シュクロースに対するスパイク信号の記録に成功している。現在、桑葉抽出物に摂食行動を示すトランスジェニック系統から、桑葉抽出物に対するスパイク信号の記録を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度の到達目標(1)-(5)に対する進捗状況を説明する。
(1)クワコと寄生バエの２種について、成虫肢で発現する味覚受容体候補遺伝子をリストアップする…採集した寄生バエのコロニー樹立が難しいことから、クワコのみを用いた解析に集中した。予定通りに成虫肢のRNA-seqを実施し、味覚受容体候補遺伝子（既知のGrやIrと構造が類似したタンパク質遺伝子）のリストアップに成功した。
(2)リストアップした候補遺伝子に関して、定量PCRを用いた発現検証を行う…産卵選好性に寄与する味覚受容体遺伝子は、雄よりも雌で発現量が多いと予想される。RNA-seqから見出された15の味覚受容体候補遺伝子に関して定量PCRを行うことで、発現量の雌雄間差を明らかにした。その結果、雌で顕著に発現量が多い9遺伝子を見出した。
(3)クワコから見出した味覚受容体候補遺伝子を発現するショウジョウバエを作製する…現在までに5遺伝子についてトランスジェニック系統が完成しており、機能解析に着手している。昨年度の目標としては、9遺伝子すべてのトランスジェニック系統の樹立を目指したが、サブクローニングにやや遅れが生じた結果となった。
(4)鱗翅目昆虫の味覚受容体がショウジョウバエ口吻で機能的に発現するかを調査する…ナミアゲハのリガンド既知の味覚受容体遺伝子（PxutGr1）を、摂食行動を司るショウジョウバエの甘味受容神経で発現させた結果、糖だけでなくミカン葉抽出物（PxutGr1のリガンドを含む）に対しても吻伸長行動が認められた。加えてハエの吻伸長行動を定量化するための、効率的な評価系も確立した。
(5)桑葉抽出物に摂食行動を示すトランスジェニック系統を見出す…現在、作製したトランスジェニック系統の中から、桑葉抽出物に摂食行動を示す系統を見出している。(1)-(5)の進捗状況を鑑みて、概ね順調に研究が進んでいると判断する。

Strategy for Future Research Activity

現在までに、クワコ成虫肢で発現する味覚受容体候補遺伝子の中から、雌成虫の産卵選好性に寄与する可能性のある9遺伝子を見出している。その内の5遺伝子については、トランスジェニックショウジョウバエが完成しており、2022年度は、これらのハエの中から桑葉の祖抽出物に応答する（摂食行動を示す）系統を見出し、リガンドスクリーニングを達成する。加えて、残りの4遺伝子に関してもトランスジェニック系統を作製し、同様に解析を進める。リガンドスクリーニングに関しては、トランスジェニック系統の摂食行動の有無を指標にして、桑葉抽出物の中から摂食誘導因子を単離・精製する。その第一段階は、摂食誘導因子が、親水性・疎水性・両新媒性分子のいずれに相当するかを明らかにする。親水性分子だった場合は、さらに酸性・塩基性・中性分子に分画する。更なる単離・精製はHPLCを駆使して行う。質量解析およびNMRの受託解析を利用することで、精製したリガンド（摂食誘導因子）の構造を明らかにする。リガンドの合成品および類似構造化合物が入手できれば、味覚受容体のリガンド認識特異性の構造的基盤を解析する。加えてリガンドに対するクワコ雌成虫の産卵選好性や、味覚感覚子の電気生理学的応答を解析する。なおリガンドの合成品が入手できない場合は、桑葉から単離・精製した物質を用いて解析を行う。また、同定した味覚受容体遺伝子のノックダウン実験も実施する。これらの実験により、同定したクワコの味覚受容体遺伝子とリガンドのセットが、桑樹に対する産卵選好性に重要なことを確認する。加えてカイコホモログの解析も行う。家畜化されてきたカイコでは、成虫肢の桑樹認識機能が衰退／欠如しているという、申請者の先行研究がある。このことを検証するために、産卵選好性に寄与するクワコの味覚受容体遺伝子を見出した後に、カイコホモログの解析にも着手する。