Development of FRET system for screening of PAD-specific inhibitors from periodontopathogenic bacteria.

2023 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 22KJ2324
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 熊谷 友樹 広島大学, 医系科学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2024-03-31
• Keywords: PPAD / Porphylomonas gingivalis / periodontal disease / Rheumatoid arthritis / citrullination / RAW264.7 cells / macrophage

Outline of Annual Research Achievements

関節リウマチ（RA）はシトルリン化酵素PADによる宿主タンパクのシトルリン化により、それに対する自己抗体産生が増悪因子の一つと考えられている。主な歯周病原細菌であるPorphylomonas gingivalis（P.g.）は口腔内細菌で唯一PAD （PPAD）を産生することが報告されRAの増悪への関与が示唆されている。そこでPPADによる宿主タンパク質の特異的シトルリン化機能を解明することで、RA病態増悪への分子生物学的な因果関係を明らかにすることを実験目的とした。
P.g.感染させたRAW264.7マクロファージ様細胞（RAW細胞）の総タンパク質および培養上清を回収しwestern blot法にてタンパクのシトルリン化を抗シトルリン化抗体によって検出した。検出されたタンパク質の分子量から、RAにおいてシトルリン化タンパク質として自己抗体産生に関与しているビメンチンのシトルリン化を確認した。P.g.によるビメンチンのシトルリン化を詳細に検討するため、P.g.もしくは精製されたPPADと反応させたビメンチン用いてwestern blot法を行い、ビメンチンのシトルリン化を検出した。現在、PPADによるビメンチンのシトルリン化部位の詳細を決定するために質量分析を行っている。
PPADの機能をさらに明らかにするために、P.g.野生株、PPAD欠損株あるいは抗PPAD中和抗体を用いてRAW細胞の増殖、炎症性サイトカイン産生および貪食能についても検討した。PPADの欠損によりP.g.の増殖能が向上したが、感染させたRAW細胞の増殖能には影響を与えなかった。P.g.感染によりRAW細胞のTNF-α産生を誘導したが、PPADの欠損や抗体による中和はそれに影響を与えなかった。
以上の結果から、P.g.が宿主タンパク質のシトルリン化に関与しており、細胞機能に影響を与えている可能性が示唆された。