2023 Fiscal Year Annual Research Report
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22KJ2348
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
花木 駿介 山口大学, 共同獣医学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| Keywords | プロリン / 異性化 / ヒストン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロリンの異性化の生物学的意義が従来未解明である原因は、基質検証の困難さであると推察されるため、アッセイ系構築は重要である。そこでプロリンの異性化を検出する方法として、キモトリプシン法の構築を行なった。最初にキモトリプシン法に用いるヒストンペプチドの合成を行った。FKBP52が異性化すると推測されるプロリン残基までは通常のペプチド配列を合成し、直後にフェニルアラニンとペプチジル-パラニトロアニリンを融合させた。合成ペプチドはプロリン残基が異性化されることによりキモトリプシンによりペプチジル-パラニトロアニリンが遊離し吸光度が上昇する。FKBP52の添加により、吸光度が増加したことから、FKBP52はヒストンペプチドを異性化することが分かった。FKBP52の酵素活性を欠損させた変異体では、吸光度は変化せず、酵素活性依存的に異性化することが明らかになった。ヒストンのプロリンのシス-トランス構造変化がどのような因子との結合に影響を与えるのか明らかにするために、ヒストン野生型と特定のプロリンをトランス体に模倣する変異体を発現させ、免疫沈降により精製し、結合分子の質量分析を行った。ヒストン野生型と比べてトランス体を模倣した変異体に対して結合が変動する因子を取得し個別に解析を進めた。さらにFKBP52の翻訳後修飾が酵素活性や相互作用に与える影響を検討するために、His-FLAGタグ付きFKBP52のバクミドを作製し、Sf21細胞にトランスフェクションすることでFKBP52発現用バキュロウイルスを調製した。FKBP52を精製後、がん細胞のタンパク抽出液と反応させプルダウンにより相互作用分子との結合を評価した。結果、バキュロウイルスで発現させたFKBP52は機能的であることを確認できたため、この系において各種ドメイン変異体を作製し酵素活性および相互作用に対する影響を評価しようと試みている。
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