転写因子c-Mycと相互作用するタンパク質の絶対定量解析

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J21238
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 立石 千瑳 九州大学, 医学系学府, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: c-Myc / プロテオミクス

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、大規模ターゲットプロテオミクスプラットフォームであるiMPAQT法を用いたc-Mycインターラクトームの機能的役割と、c-Mycインターラクトームとがんの関係性について、解明することである。そのために、これまでの研究により同定を行った相互作用因子136種類を対象にiMPAQT法を用いた絶対定量解析を行う。
第一に、iMPAQT法を行うために必要な内部標準ペプチドを作製し、LC-MS/MSによるMRMを実施することによってc-Myc相互作用因子の絶対定量が可能であることを確認した。
第二に、レトロウイルスを用いて野生型c-Myc、12 種類のドメイン欠損変異体c-Myc、および11 種類のがん関連点変異体c-Mycを安定的に発現する細胞の樹立後、これらの細胞から精製したc-Myc複合体を用いてiMPAQT法を用いた絶対定量解析を実施した。得られた定量値から各相互作用因子のc-Mycに対する結合比を算出し、ここまでで得られた知見を各相互作用因子の複合体や分子機能などの既存の情報と統合を行った。
そこで今後は、これらの結果から得られたc-Mycインタラクトームに重要であると推測された相互作用因子について、培養細胞系を用いて各遺伝子の過剰発現やノックダウンを行い、細胞増殖能の評価やRNAseq解析等の網羅的な遺伝子発現量解析を実施する。これによりc-Mycと各遺伝子の相互作用の意義や役割について明らかにする。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題の昨年度の研究計画は、c-Myc過剰発現細胞の樹立後、これらの細胞からc-Myc複合体を精製し、iMPAQT法に用いて絶対定量解析することであった。申請者は実際にこれらを実施し、c-Myc相互作用因子136種類がc-Mycに結合する定量値を算出した。
まず、野生型c-Myc複合体とドメイン欠損変異体c-Myc複合体の定量値を比較することにより、各相互作用因子のc-Myc結合部位を同定した。その結果、これまでの既存の情報と本研究で取得した相互作用因子のc-Myc結合部位の情報に整合性が取れていたことに加えて、本研究により同定された相互作用因子のc-Myc結合部位の情報を新たに取得することができた。さらに、野生型c-Myc複合体とがん関連点変異体c-Myc複合体の定量値を比較することにより、c-Mycへの結合量が変化する相互作用因子をいくつか同定した。

Strategy for Future Research Activity

昨年度までに、がん関連点変異体c-Myc過剰発現細胞においてc-Mycへの結合量が変化する相互作用因子をいくつか同定した。そこで今後はその細胞を用いて、細胞増殖能の評価、さらにRNA-seq解析等の網羅的な遺伝子発現量解析を実施し、がんの分子メカニズムにおけるc-Mycと各遺伝子の相互作用の意義や役割について明らかにする。
また、これらの研究結果を論文にまとめて発表を行う予定である。