2021 Fiscal Year Annual Research Report
細菌を用いた植物由来芳香族からの物質生産を実現するための外膜トランスポーター研究
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21J00894
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | High Energy Accelerator Research Organization |
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Principal Investigator |
藤田 雅也 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特別研究員(PD) (50923471)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2024-03-31
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| Keywords | 外膜トランスポーター / リグニン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、当初の予定通り、大腸菌で封入体として発現させ、refoldingにより精製した2種類の細菌外膜タンパク質の、200 kVクライオ電顕を用いた単粒子解析を行った。タンパク質濃度や界面活性剤の検討により、15オングストロームほどの分解能ではあるが、大まかな構造を明らかにすることができた。しかし、これらトランスポーターの輸送メカニズムの解明に十分な分解能ではないため、今後は300 kVのクライオ電顕を用いた高分解能なデータセットの取得を試みる。クライオ電顕による単粒子解析と並行して、KEKの結晶化ロボットを用いた結晶化スクリーニングも行った。その結果、1つのタンパク質の結晶化条件を明らかにすることができた。取り込みに必要なその他のcomponentについては精製が完了しているため、今後、外膜タンパク質との共構造を解析やITC解析により、詳細な輸送メカニズムを明らかにする予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新型コロナ感染症流行の影響があり、前半は在宅勤務が多かったものの、目的のタンパク質の精製と結晶化、単粒子解析での概形の観察は達成している。以上に加えて、当初の計画には含まれていなかったが、細菌の内膜で芳香族化合物を取り込むトランスポーターの精製および結晶化にも成功しており、今後は別のプロジェクトで、これらのトランスポーターについても構造解析を行い、詳細な輸送メカニズムを明らかにする予定である。以上より、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、構造解析に十分な質の結晶を得るために、結晶化条件の最適化を検討する。クライオ電顕単粒子解析や結晶化スクリーニングにより、良好な結果が得られているため、来年度での構造決定が可能であると考えている。上記に加えて、等温滴定型熱量測定 (ITC)を用いた、外膜タンパク質と基質との相互作用解析を行った。本研究で扱うファミリーに属するタンパク質の基質との相互作用で発生する熱は、微弱であることが知られており、今後はbufferのミスマッチを軽減するために、透析やnanodiscへの再構成を検討する予定である。
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Research Products
(2 results)
