再生時特異的に機能する転写因子を起点とした両生類四肢再生過程を駆動する機構の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 21J40185
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 川住 愛子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2021-04-28 – 2024-03-31
• Keywords: 四肢再生 / 形態形成 / ゲノム編集 / トランスクリプトーム解析 / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / RNA-seq

Outline of Annual Research Achievements

ツメガエルは高い再生能力をもっており、幼生期に四肢を切断しても完全に再生することができるが、変態後の幼若個体では再生能力が低下して主に１本の軟骨と表皮からなるパターンのない構造（スパイク）しか再生できない。
本研究では、これまでに再生能力の高い幼生の四肢再生・発生過程における形態形成期についてトランスクリプトーム比較解析を行い、再生領域特異的に発現上昇する遺伝子10個を同定、そのうち最も再生特異性の高い2つの転写因子（X1, X2）について、ネッタイツメガエルにおいてゲノム編集によりKO個体を作製し（機能欠損解析）、またアフリカツメガエルにおいて熱ショック応答により遺伝子発現を誘導できるTransgenic個体を作製していた（機能獲得解析）。その結果、KO幼生の四肢再生において約4割の個体で形態形成遺伝子発現パターン異常が、またTg幼若個体の四肢再生において約３割の個体で先端が２～３本に分岐した軟骨をもつ再生四肢が確認されていた。
本年度はX1およびX2のKO個体ならびに過剰発現個体における形態形成遺伝子発現パターン確認の追加実験と細胞増殖パターン確認を行った。
まず幼生KO個体でRNAscopeアッセイとリアルタイムPCR解析を行ったところ、遠位/後方パターニング遺伝子発現が野生型に比べて有意に低下していた。一方、過剰発現Tg(+)幼若個体では遠位ならびに後方パターニング遺伝子がTg(-)個体に比べて有意に発現上昇した。
さらに、遺伝子X1の幼生KO個体/過剰発現Tg(+)幼若個体の四肢再生において、再生遠位領域の低形成/膨大がそれぞれ確認されたため、それぞれの形態変化が現れる少し前の再生遠位領域における細胞増殖パターンをリン酸化ヒストンH3の免疫染色によって確認したところ、それぞれコントロールに比べて増殖細胞数が有意に減少/増加していた。
これらの結果を含め、遺伝子X1とX2がツメガエル四肢再生に果たす役割について述べた論文を作成し、投稿した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

遺伝子X1, X2の機能獲得解析を目的としたTransgenic個体作製, 熱ショック実験系の確立, 四肢再生に関する表現型解析（形態, 遺伝子発現, 細胞増殖）については計画以上に進展し、来年度に行う予定だった論文作成と投稿まで完了した。
論文投稿を優先したため、遺伝子X1, X2の下流シグナル解析を目的としたCUT&RUN解析とトランスクリプトーム解析については、実験系の確立に取り掛かったところである。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子X1, X2の下流シグナル解析を目的としたCUT&RUN解析とトランスクリプトーム解析とデータ解析を行う。また熱ショック応答により遺伝子X1, X2発現を誘導できるTg幼若個体と遺伝子X1, X2のKO幼生の四肢再生領域を対象としたscRNA-seqを行う。