2022 Fiscal Year Annual Research Report
Reconstitution and functional analyses of gliding machinery in Mycoplasma using minimal cell
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22J00711
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
水谷 雅希 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2022-04-22 – 2025-03-31
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| Keywords | 合成生物学 / ゲノムクローニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はMycoplasma mobile滑走運動に関わる遺伝子群のクローニングを主に行った。滑走運動に関わることが示唆されている７つのオペロンについて，繋げたい相手のオペロンの末端配列を持つプライマーを用いてPCR増幅し，Gibson assembly法を用いて連結し，大腸菌に形質転換した。コロニーを培養し，７つのオペロン間にある６つの繋ぎ目を標的としたマルチプレックスPCRによって連結の成否を確認した。その後，次世代シークエンス解析によって変異の確認を行ったところ，どのコンストラクトも恐らくPCRエラーに起因する数塩基の変異が見つかった。
これと並行して，合成細菌JCVI-Syn3Bの低温適応化を行った。Mycoplasma mobileの成育至適温度は約25℃であるのに対し，JCVI-Syn3Bの成育至適温度は約37℃であるため，JCVI-Syn3Bでのタンパク質発現においてミスフォールディングが起こる可能性が危惧される。そこで実験室適応進化系を用いて本来培養不可能な25℃での培養が可能な進化型JCVI-Syn3Bを作製することに成功した。
また，Mycoplasma mobileを基にした遺伝子操作法の開発も行っており，oriCプラスミドを設計し，形質転換を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Mycoplasma mobileの全ゲノムクローンおよび滑走遺伝子群のクローンを作製することができた。また，本来培養不可能な25℃での培養が可能な進化型JCVI-Syn3Bを作製することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に，得られたクローンを低温適応進化型JCVI-Syn3Bに導入する。またクローンの変異箇所を酵母CRISPR/Cas9法を用いて修正する。遺伝子導入後，SDS-PAGE法を用いてタンパク質の発現を確認するとともに，光学顕微鏡観察によって菌の形態や運動性の変化を調べる。タンパク質の発現量が低い場合は，JCVI-Syn3Bで高発現することが既に知られているスピラリンプロモーターを滑走遺伝子群の上流に導入することを考えている。
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