2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23000014
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
豊島 近 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 教授 (70172210)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小川 治夫 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 准教授 (40292726)
三村 久敏 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (30463904)
金井 隆太 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (50598472)
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| Project Period (FY) |
2011-05-31 – 2016-03-31
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| Keywords | イオンポンプ / 膜蛋白質 / 結晶解析 / エネルギー交換 |
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| Research Abstract |
(a)筋小胞体Ca^<2+>-ATPaseの残された中間状態と変異体の高分解能構造決定 : SERCAlaのE1(Ca^<2+>無し)状態に関し、調節蛋白質サルコリピン結合・非結合状態での結晶化に成功し、Nature誌に発表した。これは、カルシウムポンプの調節機構に関する大きな前進である。この結晶を種々のイオン環境にすることで、Ca^<2+>結合の初期過程に重要な示唆が得られた。また、この研究で、アデノウィルス・COS細胞を用いた高等動物膜蛋白質の大量生産・精製系を確立できた。変異体に関しては、膜内通路のゲートであるE309変異体の複数の状態の結晶化に成功し、側鎖の一原子の改変が極めて大きな構造変化を起こしえることを明らかにした。一方、疾病との関連で重要なSERCA2A/Bの大量発現にも成功し、複数の状態での結晶化にも成功した。
(b)Na^+, K^+-ATPaseの反応中間体と薬物との複合体の構造決定 : E1～P・3Na^+・ADP状態の2.8Å分解能の構造決定に成功し、Nature誌に報告した。この結果、3つのNa^+結合サイト間の協働性やNa^+の選択機構などが明らかになり、多くの疾病にかかわるナトリウムポンプの研究に本質的な進展をもたらすことができた。また、抗生物質であるオリゴマイシンの結合様式も明らかにできた。さらに、複数の強心配糖体との複合体の結晶構造解析を進め、高分解能での構造決定に成功した。さらに、大量生産・精製系を開発した。
(d)植物液胞のH^+ポンプであるH^+-PPaseの高分解能構造決定 : これまでの結晶は生理的条件とはかけ離れた条件で得られたものであったため、生理的条件に戻したところ、ヘリックスとMg^<2+>の異なった動きが観察された。また、この結果に基づき、反応サイクルを説明する構造モデルを構築することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Ca^<2+>-ATPaseに関しては、アデノウィルス・COS細胞系による大量生産・精製系を確立できた結果、予定よりも早く、疾病との関係できわめて重要なSERCA2Aの複数の状態での結晶化に成功した。Na^+, K^+-ATPaseに関しては、ついにNa^+結合状態の構造をNa^+を解像できる分解能で決定することに成功し、Na^+の選択機構が明らかになるなど、本質的な進歩をもたらすことができた。さらに、複数の強心配糖体との複合体の高分解能での構造決定に成功し、開発段階にある薬物との結晶化にも成功するなど、当初計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
心臓病との関連で、SERCA2Aの結晶化と構造決定に成功したことは非常に大きな進展である。サルコリピンより直接的にSERCAの制御に関わるフォスフォランバンの大量生産にも成功したので、SERCA2Aとの共結晶化を試みる。変異体の構造解析に関しては、これまではほぼE309に限られていたが、構造的に重要な役割をもつ他の変異体がわかったので、その生化学的研究と構造解析を進める。SERCAの中ではもっとも普遍的に存在するSERCA2Bの構造決定をも進める。一時的に停止していた、マラリア原虫のイオンポンプに関しても人員の手当てが出来たので、精力的に進めることができる。Na^+, K^+-ATPaseに関しては、強心配糖体との構造決定を収束させ、発表することが直近の目標である。同時に他の生理的状態の構造解析も進める。
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