2011 Fiscal Year Annual Research Report
炭素ー窒素結合切断および合成酵素群の統括的機能解明と応用開発
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23228002
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Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
小林 達彦 筑波大学, 生命環境系, 教授 (70221976)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東端 啓貴 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (20344864)
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| Keywords | 微生物 / 酵素 / バイオテクノロジー |
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| Research Abstract |
炭素-窒素結合合成酵素に関して、C-N三重結合を形成する反応を触媒する（Pseudomonas chlororaphis B23株の）アルドキシムデヒドラターゼ（以下OxdA）の構造機能解析結果を以下に記載する。
種々の沈殿剤を用いてハンギングドロップ法により、OxdAの結晶化を試みた。硫酸アンモニウムやグリセロールの沈殿剤を使用した時に、赤色を呈した結晶が得られた。本OxdA結晶にX線を照射することによって1.8Åの解像度で立体構造を決定した。活性中心のヘム鉄から6Å以内のdistal側には、（先行研究で既に明らかとなっているH320以外に）E143, S174, R178, S219, Q221, Y234, N279 が位置し、反応機構に関与する可能性のあるアミノ酸残基の候補と推測された。これらをアラニンに置換した変異酵素の発現プラスミドを各々構築し、大腸菌で発現させた。DEAEカラムクロマトグラフィーまでの精製ステップで、E143A, H169A, S174A, Q221A, Y234A, N279A変異体に関しては活性が著しく減少するものはなかった。しかし、E143とQ221は必須アミノ酸との間で水素結合を通して触媒に関与する可能性があるため、E143A,R178A,S219A,Q221A変異体を各々完全に精製した。E143AとQ221Aは酵素活性が低下しなかったが、R178Aは野生型OxdAの約20%に活性が低下し、S219Aは酵素活性が認められなかった。S219A変異導入はヘム含有量や二次構造に影響を与えないにも関わらず、酵素活性が消失したことから、OxdAによる炭素-窒素三重結合形成反応においてS219は重要なアミノ酸であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
X線構造解析で用いる結晶の作成に際し、種々の沈殿剤や結晶化方法の条件を検討したが、OxdA結晶をなかなか得ることができないため当初の想定より遅れてしまった。しかし、結晶化条件のみならず、OxdAの精製方法まで検討することにより目的の結晶を作成することができた。
また、発現量が著しく低下したOxdA変異酵素が存在し、野生型OxdAの精製手順では同様の精製レベルまで精製できないため当初の想定より遅れてしまった。しかし、それぞれの変異酵素について大量培養および大量精製し、酵素活性など、各種生化学的解析を行うことで、炭素-窒素結合合成に重要なアミノ酸を予想することができた。新規炭素-窒素結合切断酵素を保持する微生物についても候補株が取得でき、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
候補として取得できた新規炭素-窒素結合切断酵素を保持する微生物については、新規炭素-窒素結合切断酵素を取得する予定である。
炭素-窒素三重結合合成酵素を含む既存酵素についても、部位特異的変異を行い各種変異酵素を構築・精製するとともに、既存酵素の反応機構を解明すべく変異酵素の生化学的解析（諸性質の解明）を行う。
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