2013 Fiscal Year Annual Research Report
炭素ー窒素結合切断および合成酵素群の統括的機能解明と応用開発
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23228002
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
小林 達彦 筑波大学, 生命環境系, 教授 (70221976)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東端 啓貴 東洋大学, 生命科学部, 准教授 (20344864)
熊野 匠人 筑波大学, 生命環境系, 助教 (70585025)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 微生物 / 酵素 / 代謝 / 精製 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炭素-窒素結合分解・合成酵素群の中で、（他の酵素に関しては継続して研究を進めているが）現在、細胞壁合成に関わる酵素による有用物質生産、およびニトリル前駆体アナログ分解酵素を保持すると示唆される微生物に関して得られている成果について以下に記載する。
グラム陽性菌細胞壁のテイコ酸のD-アラニル化に関わる初発酵素はチオエステル結合形成反応を触媒するが、D-アラニンとL-システインを基質として反応させたところ、反応産物がD-アラニンとL-システインのジペプチドであると同定し、本酵素がペプチド(C-N)結合形成能も示すことを前年度までに発見していた。
（D-アラニンの代わりに）各種アミノ酸とL-システインを基質として反応させたところ、いくつかの組合せにおいて反応が進行し、HPLCによる反応産物の分離および LC-MS/MS 分析を行った結果、ジペプチドが反応産物として得られていることを明らかにした。さらに、D-アラニンを (L-システインの代わりに) アミノ酸あるいはペプチドと反応させた場合にも、いくつかの組合せにおいて反応が進行し、反応産物の分離および同定を行った結果、ジペプチド、オリゴペプチドなどが反応産物として得られることを発見した。
C-N三重結合合成酵素であるアルドキシムデヒドラターゼの基質特異性を調べる過程で、基質となり得ないニトリル前駆体アナログ化合物を発見した。このC-N結合を持つ物質の代謝に関してはこれまで知られていないことから、今年度より、このニトリル前駆体アナログ化合物代謝能を持つ微生物のスクリーニングを行った。集積培養により単離した菌株を用いて活性測定を行ったところ、ニトリル前駆体アナログ分解活性が認められた。また、ニトリルとは異なる化合物が反応生成物として検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本来はチオエステル結合形成反応を触媒する酵素（グラム陽性菌細胞壁のテイコ酸のD-アラニル化に関わる酵素）がペプチド(C-N)結合形成能も示すことを前年度に発見していたが、今年度では、本酵素を用いてD-アラニル-L-システインだけでなく、様々なジペプチド・オリゴペプチドを酵素合成できることを明らかにし、これまでに報告のない新たなペプチド合成法を開発した。
ニトリル前駆体アナログについても新たに本化合物を分解する微生物をスクリーニングし、単離することに成功した。分解産物を同定した結果、新規酵素であることが強く示唆され、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ニトリル前駆体アナログ代謝能を持つ微生物については、培地成分や培養時間の検討を行い、最適な培養条件を決定するとともに、大量培養した菌体からニトリル前駆体アナログ分解酵素を単離精製し諸性質を解明する予定である。
既存のC-N結合切断酵素や、大量精製が可能となった新規C-N結合切断酵素については、引き続き、結晶化・X線構造解析によって３次元構造を解明する。立体構造から得られる情報等を基に、活性中心と予想されるアミノ酸残基を対して部位特異的変異法により変異酵素を作成し、活性測定等を行うことで活性アミノ酸残基を同定する。
さらに、本来はチオエステル結合形成反応を触媒する酵素が何故ペプチド(C-N)結合形成反応を触媒し得るか詳細に明らかにする。
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| Remarks |
研究室ホームページ
http://www.microbes.agbi.tsukuba.ac.jp/kobayashi/
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