2012 Fiscal Year Annual Research Report
糖鎖プライマー法を活用した新規グライコミクスを基盤とする細胞機能の解析と制御
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23241075
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
佐藤 智典 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (00162454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松原 輝彦 慶應義塾大学, 理工学部, 講師 (10325251)
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| Project Period (FY) |
2011-11-18 – 2016-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 糖鎖プライマー / 糖脂質 / Oーグリカン / 質量分析装置 / オリゴ糖 / 糖鎖解析 / 転移性がん細胞 |
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| Research Abstract |
各種がん細胞を用いて比較グライコミクスを糖鎖プライマー法などにより実施した。特に、転移性のがん細胞などを用いることで、糖脂質型および０―グリカン糖鎖の発現解析を行なった。他の細胞を含めた各種幹細胞の分化誘導による発現糖鎖の変化についても検討した。これにより、肺がん細胞や骨肉腫細胞の転移性に関与する糖鎖を明らかにした。さらに、C型肝炎ウイルス(HCV)の感受性を有する細胞での糖鎖構造の解析を行い、HCVゲノム複製に関与する糖鎖を見いだした。ヒトiPS細胞での発現糖鎖解析を実施し、未分化状態のiPS細胞に特異的に発現する新規の糖鎖マーカーを見いだした。以上で用いた細胞において見いだされた特徴的な糖鎖に対する合成遺伝子を定量PCR法により検出した。これにより、糖鎖構造の発現と糖鎖合成遺伝子の発現レベルとの関連性を明らかにした。糖鎖合成遺伝子をsiRNAによりノックダウンを行うことで、がん細胞の転移性を制御できることを明らかにした。以上の様に、糖鎖の解析技術を元にして、細胞の機能に関わる糖鎖を明らかにすることで、創薬ターゲットを明確にし、再生医療における幹細胞の品質評価についても有用な情報を得ることができた。また、糖鎖構造解析ツールの開発を行なった。迅速かつ信頼性の高い糖鎖のマススペクトルの解析を行うためのソフトウエアを開発するために、マススペクトルデータを元にして糖鎖構造を予測するアルゴリズムの構築を行なった。また、アルゴリズムの改良に用いる糖鎖のマススペクトルデータとしては、各細胞から得られた糖鎖解析の際のLC-MSのデータベースを活用する。そのために、細胞からの糖鎖の回収方法を検討して、正確なLC-MSスペクトルの測定手法の確立を行なった。異なった細胞から得られたLC-MSスペクトルデーターを用いて、オリゴ糖鎖の構造異性体を区別する手法について検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
転移性がん細胞およびヒトiPS細胞での糖鎖構造解析では、目標にしていた糖鎖の発現解析を終えることができた。その成果は、転移性骨肉腫細胞では既に論文発表を行い、iPS細胞では論文を執筆中である。糖鎖解析ツールの開発では、質量分析装置で得られる理論的なフラグメントデーターを元にした糖鎖解析のためのアルゴリズムの作成が行なえた。その解析精度を高めるためのマススペクトルデーターの取得も順調に行なっており、構造異性体を分離するための方法にも目処が立ってきた。よって、方針に沿って順調に研究は進展してきている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、LC-MSでの糖鎖のデータベースの作製と糖鎖配列解析手法の確立にむけた検討を行う。過年度の計画を継続して、糖鎖構造解析のためのアルゴリズムの改良とLC-MSでのデータベースを作製する。各種細胞で発現している糖鎖の構造解析法の開発を目指して、構造異性体の同定法などの確立を行なう。次に、インフルエンザウイルス(IFV)の検査手法と抗ウイルス剤の開発を行なう。IFVが結合する細胞の探索を行う。IFVが結合する細胞での発現糖鎖を糖鎖プライマー法により解析する。次に、アジド基を有した糖鎖ライブラリーを固定化した糖鎖アレイを用いてIFVの結合の定量的解析を行う。さらに、IFVの宿主細胞への結合性とウイルス粒子の複製との関連についても検討する。糖鎖ライブラリーを微粒子表面に固定化して、IFVとの凝集活性を観察する。本申請研究において作製した独自の糖鎖ライブラリーを活用することで、変異株であっても凝集活性が得られる微粒子を開発する。さらに、C型肝炎ウイルス(HCV) RNAの複製機構と抑制方法について、過年度に継続して更に研究を進展させる。HCVゲノム複製細胞での糖脂質の発現量とHCV RNAの複製との因果関係を明らかにする。HCV RNAの複製抑制への関与が示唆されたネオラクト系列糖鎖の生合成の原料となる糖鎖の培養液中への添加は、HCV RNAの複製を抑制することを見いだしている。そこで、その類縁体や糖鎖合成遺伝（B3GNT5など）によるHCV RNAの複製の効率的な制御方法を創出する。また、糖転移酵素の細胞内導入によるHCV RNAの複製抑制効果を検証する。当初の研究計画に沿った検討を実施し、大きな計画の見直しは行なわない。
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