2013 Fiscal Year Annual Research Report
単離細胞を用いた非視覚型ロドプシン類の機能多様性に関する分子生理学的解析
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23247011
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
寺北 明久 大阪市立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (30212062)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ロドプシン類 / 非視覚型オプシン |
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| Research Abstract |
1)昨年度の解析の結果、ハマダラカのエンセファロプシンが13シス型レチナールを発色団として結合し、機能発現することが分かった。そこで、13シスレチナール結合能を支える構造基盤を、部位特異変異体を作製して解析した。13シス型を結合できない近縁のロドプシン類との比較から、発色団近傍の２カ所の残基の変異体を作製した。その結果、１つの変異体では吸収極大が大きく変化したが、この２カ所の残基だけでは13シス型レチナールの結合能を説明できないことが分かった。
2)本年度は、前年度に引き続き、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識されたメラノプシン2発現水平細胞を単離して、光依存的な応答が起こるのか を、カルシウムイメージングや電気生理学的な方法等で解析した。カルシウムイメージングについては、GFPの 励起・蛍光スペクトルとは異なる特性を持つ指示薬X-Rhod-1を用いて解析した。その結果、メラノプシン２発現培養細胞では明瞭なカルシウム応答を観察されたが、単離メラノプシン発現水平細胞では明瞭な反応が観察されなかった。このことから、メラノプシン発現水平細胞では、培養細胞で起こる細胞内小胞からのカルシウム放出ではなく、他の光応答がおこっている可能性が考えられた。電気生理学的解析の準備として、単離水平細胞に細胞内電極を挿入し、色素を注入することに成功した。
また、メラノプシン2の上流配列下で cAMP感受性の発光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの系統の作製に成功した。
(3)頭索動物ナメクジウオにおいて、前年度に見出したアレスチンが多量に存在する光受容細胞と予想される細胞について、どのような光受容タンパク質が存在するのかを、in situ hybridizationや免疫組織学的手法を用いて行い解析し、そこに存在する光受容タンパク質とGタンパク質の同定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、カルシウムイメージングにおいて、使用できるカルシウム指示薬が明確になり、少なくとも培養細胞を用いての解析系を確立することができた。また、電気生理学的解析において、電極をメラノプシン発現単離水平細胞に挿入し、色素の細胞内注入に成功した。さらに、メラノプシン2の上流配列下で cAMP感受性の発光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュの系統の作製に成功した。これらの結果から、メラノプシン２発現水平細胞の光応答の測定の基礎的な準備が整ったと言える。
また、頭索動物ナメクジウオにおいて、前年度に見出したアレスチンが多量に存在する光受容細胞と予想される細胞に存在する光受容タンパク質とGタンパク質の同定に成功し、メラノプシン発現細胞の進化を考える上で重要な知見を得ることができた。
以上のことから、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は最終年であるので、これまで確立してきた、電気生理学的方法とカルシウムイメージングの技術を駆使して、単離水平細胞の光応答の解析を推進する。また、細胞内シグナル伝達を直接モニターできるセカンドメッセンジャー感受性の発光タンパク質遺伝子を導入したゼブラフィッシュを作製し、利用することによる解析も進める。
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Research Products
(23 results)
