2011 Fiscal Year Annual Research Report
アルツハイマー病モデルサル、脳におけるヒト変異型APP強制発現と老人斑形成
Project/Area Number |
23300155
|
Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
Research Institution | Shiga University of Medical Science |
Principal Investigator |
中村 紳一朗 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 准教授 (50307980)
|
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西村 正樹 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 准教授 (40322739)
松尾 明典 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 講師 (20324585)
|
Keywords | アルツハイマー病 / アミロイドβ / AAVベクター / カニクイザル |
Research Abstract |
アルツハイマー病(AD)モデル動物としての高齢サルの問題点を克服するため、ヒトの家族性ADの原因遺伝子であるアミロイド前駆体タンパク(APP)をウイルスベクターで組み換えたコンストラクトをサルの脳内に接種し、強制発現させ、老人斑が形成されるようになることを目的とする。実験的かつ計画的に、明確な時間内にサル類でAD関連病変をつくれるようになれば、AD研究に大きく貢献できる。 昨年度は脳組織へ導入するアデノ随伴ウイルス(AAV)-2(AAV-2)ベクターに組換える目的遺伝子を作製した。先ず病態を引き起こすためのswAPP(変異型APP、病因遺伝子)をFLAG(標識遺伝子)と結合させた。さらにAAV-2ベクターへ導入するために必要なAAV-2 in verted terminal repeat (AAV-2への導入遺伝子)とswAPPおよびFLAGが結合したコンストラクトを作製した。そして、これら3種の遺伝子が結合したコンストラクトを含むプラスミドを、大腸菌の多量の培養によって増殖させ、目的遺伝子を搭載したAAV-2を作製するために必要十分なプラスミドを精製した(Qiagen, Gigakit)。 動物の体内に接種するために必要な量の飴V-2を産生するためには、1)上記で作製した遺伝子を持つプラスミド、2)AAV-2の骨格を形成する遺伝子(AAV-2 rep,AAV-2 cap)を持つプラスミド、3)AAV-2の複製に関わるAdeno virusの遺伝子(adeno E2A,adeno E4)を持つプラスミドが、それぞれ多量に必要で、それらをAdeno virus由来遺伝子(Adeno E1A, Adeno E1B)が導入されたHEK293細胞(AAV293細胞:ヒト胎児腎由来)へトランスフェクトすると、AAV293細胞内で目的遺伝子を搭載したAAV-2が完成する。1)の多量のプラスミド精製はすでに行われたので、次年度は2)と3)の多量のプラスミド精製を行う。またこれらのトランスフェクトからAAV-2の産生はその分野の専門家である国立精神・神経医療研究センター研究所の岡田尚巳博士の協力を得る。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物の体内に接種するために必要な量のAAV-2ベクターを作ろうとしたが、予想よりも多量の上記1)から3)のプラスミドをAAV293細胞で混和しなければならないことが明らかになった。少量の混和による実験死かできなかったため、目的量のAAV-2ベクターを得ることができず、やや当初の進行予定より遅れることとなった。
|
Strategy for Future Research Activity |
適切にAAV-2ベクターを作製することができるように、ウイルスベクター設計の専門家である国立精神・神経医療研究センター研究所の岡田尚巳博士に、研究分担者として協力していただくことになった。これによって、目的量のAAV-2ベクターを得ることが可能となる。本年度はAAV-2の増殖に最適化された培養細胞を用いて、導入効率のアッセイを行ったのち、マウスへの脳内接種を試みる。さらに数ヶ月のちに病理解剖を行い、脳を摘出、FLAG、アミロイドβを検出するためのウェスタンブロット、ELISA、免疫染色を行う。
|
-
[Journal Article] Human Neural Stem Cells Overexpressing Choline Acetyltransferase Restore Cognitive Function of Kainic Acid-Induced Learning and Memory Deficit Animals2012
Author(s)
Park D, Joo SS, Kim TK, Lee SH, Kang H, Lee HJ, Lim I, Matsuo A, Tooyama I, Kim YB, Kim SU
-
Journal Title
Cell Transplantaion
Volume: 36(5)
Pages: 365-371
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Human Neural Stem Cells Overexpressing Choline Acetyltransferase Restore Cognitive Function of Kainic Acid-Induced Learning and Memory Deficit Animals2012
Author(s)
Ueda M, Ageyama N, Nakamura S, Nakamura M, Chambers JK, Misumi Y, Mizuguchi M, Shinriki S, Kawahara S, Tasaki M, Jono H, Obayashi K, Sasaki E, Une Y, Ando Y
-
Journal Title
Laboratory Investigation
Volume: 92(3)
Pages: 474-484
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ432011
Author(s)
Saito T, Suemoto T, Brouwers N, Sleegers K, Funamoto S, Mihira N, Matsuba Y, Yamada K, Nilsson P, Takano J, Nishimura M, Iwata N, Van Broeckhoven C, Ihara Y, Saido TC
-
Journal Title
Nature Neuroscience
Volume: 14(8)
Pages: 1023-1032
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] lternative processing of γ-secretase substrates in common forms of mild cognitive impairment and Alzheimer's disease : Evidence for γ-secretase dysfunction2011
Author(s)
Hata S, Fujishige S, Araki Y, Taniguchi M, Urakami K, Peskind E, Akatsu H, Araseki M, Yamamoto K, Martins RN, Maeda M, Nishimura M, Levey A, Chung KA, Montine T, Leverenz J, Fagan A, Goate A, Bateman R, Holtzman DM, Yamamoto T, Nakaya N, Gandy S, Suzuki T
-
Journal Title
Annals of Neurology
Volume: 69(9)
Pages: 1026-1031
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-