2011 Fiscal Year Annual Research Report
活性動態の理解に基づいた脱ユビキチン化酵素の機能解明
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23310160
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
服部 明 京都大学, 薬学研究科, 准教授 (50300893)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大石 真也 京都大学, 薬学研究科, 講師 (80381739)
藤原 浩 京都大学, 医学研究科, 准教授 (30252456)
井上 英史 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (20184765)
丸山 正人 関西医科大学, 医学部, 講師 (00399445)
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| Keywords | プロテアーゼ / ユビキチン / 脱ユビキチン化酵素 / activety-based probe / 酸化ストレス |
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| Research Abstract |
ユヒキナン更Ub)をベースとした脱ユビキチン化酵素(DUB)に対するactivity-based probeの作製を行った。DUB活性中心のシステイン残基と共有結合を形成しうる官能基を有するアミンを数種類合成し、別途リコンビナントタンパク質技術を利用して調製したUb(1-75残基目をコード)のC末端に付加した。種々の検討の結果、probe調製における適切な条件ならびに精製方法を確立した。特に、probe合成に最大の障壁となっていたアミンとの縮合反応の改良を試みた結果、強アルカリ性で水分子の混入を最小限に抑えることで、ほぼ完全に目的の反応が定量的に進行することを確認した。これら検討によって今後のprobeあるいはDUB基質作成の効率が格段に上昇した。
開発したDUB基質(Ub-granzyme B)および市販の基質(Ub-AMCおよびLRGG-AMC)を利用して、酸化ストレスや低酸素状態に曝した培養細胞株中のDUB活性変化を解析した。その結果、3基質に対する各分解活性は細胞ストレスの種類に応じて異なった感受性を示した。酸化ストレス刺激した際には、用いたすべての基質に対する分解活性が著しく低下することが明らかとなった。そこで現在、酸化ストレス感受性のDUBの同定をUb activity based probeを活用して進めている。
新規のDUBであるUbiqitin specificprotease(USP)-47の酵素学的性状解析には、開発したUb-granzyme Bが有効であることが示された。そこで、Ub-granzyme Bを利用して本酵素の酵素学的性状の解析を行った結果。USP-47の活性がTosyl phenylalany lchloromethyl ketoneによって阻害されることを見出した。また本酵素はLys48結合型ポリUb鎖に対する消化能のみならずLys63結合型ポリUb鎖の消化能も有していることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
activity based probeの合成法の改良によって、作製を予定していたprobeの開発が容易になった。また、細胞ストレスに伴った細胞内DUBの活性動態も明らかになりつつあり、次年度、activity based probeを用いた分子同定に目途が立った。
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| Strategy for Future Research Activity |
ほぼ計画通りに遂行する。酸化ストレス感受性のDUBの存在を見出しつつあることから、酸化ストレスとの関わりが示唆されるユビキチン様分子をベースとしたactivity based probeの作製も視野に入れつつ解析を進める。
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[Presentation] Characterization of enzymatic properties of recombinant human specific protease 472011
Author(s)
Hattori, A., Tashiro, A., Piao, J.-H., Moriyoshi, E., Kakeya, H.
Organizer
7th General Meeting of the International Proteolysis Society
Place of Presentation
San Diego, USA
Year and Date
2011-10-18
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