2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23360367
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
中野 秀雄 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
兒島 孝明 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (40509080)
岩崎 雄吾 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (50273214)
小林 功 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品総合研究所, 研究員 (70425552)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 酵素 / スクリーニング / エマルジョンPCR / 無細胞タンパク質合成系 |
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| Research Abstract |
申請者らが独自に開発した、エマルジョンPCRと無細胞蛋白質合成系を組み合わせたDNA-蛋白質のビーズディスプレイ技術を用い、非常に大規模なライブラリー（10の9乗）を構築し、セルソーターによりスクリーニングする、ギガスクリーニングシステム（GSS）を確立することを目的として研究を行なっている。今年度は以下の様な成果が得られた。
1)昨年度に開発したDNA結合タンパク質を利用したビーズへの提示法を、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびマンガンペルオキシダーゼに適用したところ、両方のタンパク質共にビーズ上に提示され、チラミドを用いたアッセイ系により、ビーズ上で活性を確認することができた。さらにセルソーターを用いて、ハイスループットにスクリーニング可能であることを示した。
2)マイクロフォーカシング法によるW/Oエマルジョン作製装置を改良し、より均一なエマルジョンを作製することに成功した。
3)T7RNApolymerase活性のスクリーニング系を、より高活性なRNAリガーゼ活性を有するリボザイムを用いて行い、ランダムライブラリーのスクリーニングに適用した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までのところ、当初予定していたセルラーゼのアッセイシステムの構築には失敗したものの、新たにアミノ酸オキシダーゼのビーズ上でのアッセイ測定法を構築しつつあり、西洋わさびペルオキシダーゼ、カビ由来マンガンペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびアミノ酸のオキシダーゼの合計４種類の酵素のビーズ上でのアッセイシステムを確立、および確立ししつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度になり、予算も限られるので、西洋ワサビペルオキシダーゼとマンガンペルオキシダーゼのスクリーニング系を動かし、大腸菌で高活性の発現が可能になるような有用変異体を取得し、本件の有用性を示す予定である。また次世代シークエンサーを使用することで、非常に多数の変異体解析を同時に行うことで、次世代型機能タンパク質創製技術として確立する予定である。
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Research Products
(9 results)
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[Presentation] Cell-free synthesis of horseradish peroxidase and manganese peroxidase for bead display-based high-throughput screening.2013
Author(s)
Zhu, B., Ninomiya, R., Kojima, T., Iwasaki, Y., Nakano, H.
Organizer
日本農芸化学会中部支部第168回例会,
Place of Presentation
名古屋
Year and Date
20131012-20131012
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