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2011 Fiscal Year Annual Research Report

プロトクロロフィリド還元酵素とニトロゲナーゼ:安定な多重結合還元の共通反応基盤

Research Project

Project/Area Number 23370020
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

藤田 祐一  名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 准教授 (80222264)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 伊藤 繁  名古屋大学, 大学院・理学研究科, 名誉教授 (40108634)
Keywords酵素反応 / 電子伝達 / プロトン移動 / 電子スピン共鳴 / 鉄硫黄クラスター
Research Abstract

クロロフィル(Chl)生合成系酵素として初めて暗所作動型プロトクロロフィリド(Pchlide)還元酵素(DPOR)の結晶構造解析が解明され、DPORが窒素固定酵素ニトロゲナーゼと共通した構造的枠組みを有することが明らかにされた。本研究では、この構造情報を基にPchlide還元の反応機構の解明を目指している。DPORにおける触媒コンポーネントNB-タンパク質の立体構造によると、基質であるPchlideのD環C17=C18二重結合へのプロトソ供与体は、各々アスパラギン酸残基(BchB-Asp274)と基質自身のC18位プロピオン酸であると推定される。これらプロトン供与体からのプロトンと還元コンポーネントからの電子がどのように協調して基質に転移され、生成物クロロフィリドへと変換されるのか、その分子機構の解明の第一歩として、アスパラギン酸をアラニンに改変した変異タンパク質BchB-D274Aを調製し、その活性を検討した。BchB-D274Aは、BchNと複合体NB-タンパク質形成を形成するが、通常の反応条件ではPchlide還元活性を示さなかった。しかし、酵素濃度と基質を通常の約10倍で反応させると、興味深いことに、色素の吸収スペクトルの急激な減少が観察された。さらに、この反応溶液の電子スピン共鳴(ESR)解析により、有機ラジカル形成を特徴付けるg値をもつESRスペクトルが検出された。この結果は、DPORがラジカル反応を誘起することで安定な共鳴二重結合を還元していることを示しており、またDPORによるPchlide還元が基質そのものにラジカルが生じるユニークな反応であることを示唆している。今後は、C18位へのプロトン供与体をブロックするためにPchlide基質アナログであるクロロフィルcを用いた解析により、プロトン供与と電子伝達の機序を明らかにしていく予定である。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

プロトン供与体となるアスパラギン酸をアラニンに改変した酵素による反応において、吸収スペクトルおよび電子スピン共鳴スペクトルにより有機ラジカルが形成されることを同定することに成功したことで反応機構の解明に向けての大きな一歩を踏み出したと評価できることから。

Strategy for Future Research Activity

もう一つのプロトン供与体である基質プロトクロロフィリド自身のC17位プロピオン酸がアクリル酸に置換された基質アナログであるクロロフィルcを用いて、反応中間体のトラップを試みる。さらに、DPORのL-タンパク質からNB-タンパク質への電子伝達の阻害剤ニコチンアミドを併用し、2つの電子と2つのプロトンによる還元反応の作用機序を明らかにする。より大量の変異型NB-タンパク質やL-タンパク質を調製するために、新たに培養装置が必要となったので、昨年度後半に購入したので、これを活用して研究をより効率的に推進する。

  • Research Products

    (12 results)

All 2012 2011

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (8 results)

  • [Journal Article] Functional evaluation of a nitrogenase-like protochlorophyllide reductase encoded by the chloroplast DNA of Physcomitrella patens in the cyanobacterium Leptolyngbya boryana2011

    • Author(s)
      Yamamoto, H., Kurumiya, S., Ohashi, R., Fujita, Y.
    • Journal Title

      Plant and Cell Physiology

      Volume: 52 Pages: 1983-1993

    • DOI

      doi:10.1093/pcp/pcr132

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A heme oxygenase isoform is essential for aerobic growth in the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803 : Modes of differential operation of two isoforms/enzymes to adapt low oxygen environments in cyanobacteria2011

    • Author(s)
      Aoki, R., Goto, T., Fujita, Y.
    • Journal Title

      Plant and Cell Physiology

      Volume: 52 Pages: 1744-1756

    • DOI

      doi:10.1093/pcp/pcr108

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 暗所作動型プロトクロロフィリド還元酵素~ニトロゲナーゼとの構造的類似性から見る酵素の多様性と進化~2011

    • Author(s)
      藤田祐一
    • Journal Title

      生化学

      Volume: 83 Pages: 642-647

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] クロロフィルを緑にする2つの還元酵素:光依存型酵素と暗所作動型酵素の反応機構と進化的考察2011

    • Author(s)
      藤田祐一・栗栖源嗣
    • Journal Title

      生物物理

      Volume: 51 Pages: 66-71

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ニトロゲナーゼ類似型プロトクロロフィリド還元酵素の反応機構の解析2012

    • Author(s)
      野亦次郎・近藤徹・溝口正・民秋均・伊藤繁・藤田祐一
    • Organizer
      第53回日本植物生理学会年会
    • Place of Presentation
      京都産業大学(京都府)
    • Year and Date
      2012-03-18
  • [Presentation] 暗所作動型プロトクロロフィリド還元酵素のBchBサブユニットのC末端領域の構造と機能2012

    • Author(s)
      立松彩・野亦次郎・村木則文・栗栖源嗣・藤田祐一
    • Organizer
      第53回日本植物生理学会年会
    • Place of Presentation
      京都産業大学(京都府)
    • Year and Date
      2012-03-16
  • [Presentation] 窒素固定細菌としてのラン藻2011

    • Author(s)
      藤田祐一
    • Organizer
      第9回クラミドモナスワークショップ
    • Place of Presentation
      岡崎カンファレンスホール(愛知県)(招待講演)
    • Year and Date
      2011-11-26
  • [Presentation] ニトロゲナーゼ:生化学から作物増産への可能性2011

    • Author(s)
      藤田祐一
    • Organizer
      第4回微細藻類生産性研究会
    • Place of Presentation
      名古屋大学(愛知県)(招待講演)
    • Year and Date
      2011-08-05
  • [Presentation] Toward understanding of reaction mechanism of dark-operative protochlorophyllide reductase2011

    • Author(s)
      Fujita, Y.
    • Organizer
      International Conference on Tetrapyrrole Photoreceptors of Photosynthetic organisms 2011
    • Place of Presentation
      Berlin, Germany(招待講演)
    • Year and Date
      2011-07-25
  • [Presentation] ニトロゲナーゼ類似酵素連続反応:バクテリオクロロフィル生合成系とニトロゲナーゼの類似性2011

    • Author(s)
      藤田祐一
    • Organizer
      第19回光合成の色素系と反応中心に関するセミナー
    • Place of Presentation
      大阪大学(大阪府)
    • Year and Date
      2011-07-10
  • [Presentation] Structure-based functional analysis on dark-operative protochlorophyllide reductase2011

    • Author(s)
      Fujita, Y.
    • Organizer
      Gordon Research Conference, Photosynthesis
    • Place of Presentation
      Davidson College, USA(招待講演)
    • Year and Date
      2011-06-14
  • [Presentation] Creation of a new light-depndent nitrogenase2011

    • Author(s)
      Fujita, Y.
    • Organizer
      Academia Sinica-JST Joint Workshop on Innovative Use of Light and Nano/Bio Materials
    • Place of Presentation
      台北、台湾(招待講演)
    • Year and Date
      2011-05-26

URL: 

Published: 2013-06-26  

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