転写においてＲＮＡポリメラーゼが形成する過渡的な複合体の構造機能解析

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23370048
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 関根 俊一 独立行政法人理化学研究所, ライフサイエンス技術基盤研究センター, チームリーダー (50321774)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 酵素 / RNAポリメラーゼ / 転写 / 転写因子 / 校正 / Ｘ線結晶構造解析 / クロスリンク / 構造機能相関

Outline of Annual Research Achievements

RNAポリメラーゼは、転写の進行にともなって様々な構造状態をとり、他のタンパク質等と様々な複合体を形成する。それらの複合体におけるRNAポリメラーゼの構造状態を調べるために、分子内クロスリンクを用いた検出法（システインペア架橋法）を確立した。高度好熱菌のRNAポリメラーゼの二カ所にシステイン残基を導入し、S-S結合の形成効率をもとに、RNAポリメラーゼが「タイト型」と「ラチェット型」のどちらの構造状態をとっているかを判定できるようにした。これを用いて、代表的な転写複合体におけるRNAポリメラーゼの構造状態を解析したところ、これまで機能のよく分かっていなかった「ラチェット型」コンフォメーションは多くの重要な転写機能に関与していることが示された。このことから、転写の諸機能の制御は、新生RNAや転写因子に依存した、2種類の構造状態の切り替えによって達成されているという普遍的原理が示唆された。
転写伸長中のRNAポリメラーゼ（伸長複合体）は、転写エラーを起こしてミスマッチ塩基を取り込んだときなどに、一時的にDNA上を後退して転写を休止する（後退複合体）。このとき、RNAの3’末端は鋳型DNAからはがれた状態にあるが、RNAポリメラーゼはこの3’末端を切断（校正）することにより転写を再開することができる。さらに、GreA等の転写因子は、後退複合体に結合してRNA切断活性を大幅に促進し、転写の校正に重要な役割を果たしている（Gre因子複合体）。これらの複合体の結晶構造解析を行い、RNAポリメラーゼの後退およびRNA切断の構造基盤を明らかにした。RNAポリメラーゼは、後退複合体では「タイト型」を、Gre因子複合体では「ラチェット型」をとっていることが示され、システインペア架橋法による結果を裏付ける結果となった。以上の成果をまとめ、報文として発表した(Mol. Cell 2015)。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] The ratcheted and ratchetable structural States of RNA polymerase underlie multiple transcriptional functions. (2015)
  • Author(s): Sekine, S., Murayama, Y., Svetlov, V., Nudler, E., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 57 Pages: 408-421
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2014.12.014
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Time-resolved Raman and polyacrylamide gel electrophoresis observations of nucleotide incorporation and misincorporation in RNA within a bacterial RNA polymerase crystal. (2015)
  • Author(s): Antonopoulos, I.H., Murayama, Y., Warner, B.A., Sekine, S., Yokoyama, S., Carey, P.R.
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 54 Pages: 652-665
  • DOI: 10.1021/bi501166r
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Molecular basis of RNA polymerase promoter specificity switch revealed through studies of Thermus bacteriophage transcription regulator. (2014)
  • Author(s): Severinov, K,. Minakhin, L., Sekine, S., Lopatina, A., Yokoyama, S.
  • Journal Title: Bacteriophage Volume: 4 Pages: e29399
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Development of a hexahistidine-3× FLAG-tandem affinity purification method for endogenous protein complexes in Pichia pastoris. (2014)
  • Author(s): Higo, T., Suka, N., Ehara, H., Wakamori, M., Sato, S., Maeda, H., Sekine, S., Umehara, T., Yokoyama, S.
  • Journal Title: J. Struct. Funct. Genomics Volume: 15 Pages: 191-199
  • DOI: 10.1007/s10969-014-9190-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 新生RNAによるRNAポリメラーゼの構造変化と機能との相関 (2014)
  • Author(s): 関根俊一
  • Organizer: 第37回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Remarks] 理研ライフサイエンス技術基盤研究センター 超分子構造解析研究チーム
  • URL: http://www.clst.riken.jp/activity/structuralbiology_group1_team2.html
• [Remarks] 理研プレスリリース 「RNAポリメラーゼの働きを切り替えるメカニズムを解明」
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2015/20150206_3/