2012 Fiscal Year Annual Research Report

スナップショット構造を基にしたメチオニンガンマリアーゼの酵素反応機構の解明

Research Project

Project/Area Number	23370050
Research Institution	Kyoto Institute of Technology
Principal Investigator	原田繁春京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 教授 (80156504)
Project Period (FY)	2011-04-01 – 2015-03-31
Keywords	酵素反応機構 / 生体分子 / PLP酵素 / タンパク質 / 時分割X線解析 / スナップショット構造
Research Abstract	タンパク質X線解析ではほとんどの場合、安定で静的な構造の決定が行われている。一方、実際に機能している酵素では、基質が結合した後に時々刻々と構造変化しながら一連の中間体を経て酵素反応が進行する。従って、酵素の機能を真に理解するには、動的に変化する中間体構造を捉える必要がある。幸いなことに、酵素反応は結晶中でも起こるので、結晶中で反応を開始させ、次に反応を止めてX線解析すれば様々な酵素反応中間体構造を捉えることができるはずである。本研究ではメチオニンγリアーゼについて、２つのアイソザイム、１と２（MGL1、2）の反応中間体構造を決定して、酵素反応機構とアイソザイム間での基質に対する特異性の違いを解明することを目指した。 MGL1や2の結晶をメチオニン等の基質を含む抗凍結剤にソーキングして結晶内で酵素反応をスタートさせ、数百ミリ秒～数十秒後に結晶を窒素気流で100 Kに凍結して酵素反応を止め、SPring-8やPFで中間体との複合体構造を解析するために必要な高分解能・高精度データを測定した。MGL1については、すでに7種類の中間体構造を捉えることに成功しているが、MGL1よりもKmが大きくkcatが小さいMGL2ではメチオニンが結合した複合体構造が得られているだけで、反応が進行した中間体構造の解明には至っていない。今後、ソーキング条件をさらに検討する必要がある。一方、MGL1の解析から酵素反応に関わっていると考えられるアミノ酸残基について、それらの役割を実証するために、変異体（Y108F、C110S、C110G、S113E、S113Q）の発現・精製・結晶化を行い、野生型MGL1と同様に酵素反応中間体構造の解析を行うための体勢を整えた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason MGL2は基質であるメチオニンのソーキングによって結晶が壊れるという問題が発生した。そのため、ソーキング条件を確立し問題解決するために少し時間を要し、それによる遅れは完全に取り戻すことができていない。しかし、MGL1については酵素反応に関わっていると考えているアミノ酸を変えた変異体の発現・精製・結晶化ができたので、今後、それらの役割を実証していくことが可能になった。
Strategy for Future Research Activity	野生型MGL1の時分割X線解析はほぼ終了しているので、当初の予定通り野生型MGL2とMGL1変異体およびMGL2変異体について時分割X線解析を進める。また、類縁酵素として、Pseudomonas putidaのMGLと好熱菌Sulfolobus tokodaiiのシスタチオニン合成酵素についても結晶化に成功し、時分割X線解析を行う体勢が整った。これらについても解析を進め、より一般的なPLP酵素の反応機構解明を目指す。