スナップショット構造を基にしたメチオニンガンマリアーゼの酵素反応機構の解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23370050
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 原田 繁春 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 教授 (80156504)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 酵素反応機構 / 生体分子 / PLP酵素 / タンパク質 / 時分割X線解析 / スナップショット構造

Outline of Annual Research Achievements

ピリドキサール-5'-リン酸（PLP）は、アミノ酸を基質とする酵素反応に必須の補欠分子族である。様々なPLP酵素に共通の反応機構として、ミカエリス複合体を経てPLPとキノノイド中間体を形成するメカニズムが考えられている。しかし、中間体構造に基づいて証明されているわけではない。本研究では、代表的なPLP-酵素であるメチオニンγリアーゼ（MGL）の酵素反応機構を解明するため、一連の酵素反応中間体構造をX線結晶解析によって1.97～2.59 Å分解能で決定した。MGLはメチオニンをメタンチオールとαケト酸、アンモニアへの分解反応を触媒する酵素である。酵素反応中間体がMGLに結合した結晶は、リガンドフリーMGL結晶をメチオニン含有溶液に時間を変えてソーキングすることで調製した。結晶状態のMGLによって生成した反応中間体は、液体窒素で凍結して結晶内にトラップした。その結果、酵素反応中間体として、Michaelis complex、methionine-pyridoxal-5'-phosphate、methionine imine-pyridoxamine-5'-phophate、methionine α,β-enamine-pyridoxamine-5'-phophate、α- amino-α,β-butenoic acid-pyridoxal-5'-phosphateを見出すことができた。これらの中間体構造は、PLP酵素に共通の酵素反応機構が妥当であることを示すとともに、methionine α,β-enamine-pyridoxamine-5'-phophateは非酵素的にシグマトロピー反応によってからα- amino-α,β-butenoic acid-pyridoxal-5'-phosphateに変換されることを明らかにした。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Anemia amelioration by lactose infusion during trypanosomosis could be associated with erythrocytes membrane de-galactosylation (2014)
  • Author(s): E.O. Baloguna,J.B. Balogun, S. Yusuf, H.M. Inuwa, I.S. Ndams,P. Sheridan, D.K. Inaoka, T. Shiba, S. Harada, K. Kita, K.A.N. Esievo, A.J. Nok
  • Journal Title: Veterinary Parasitology Volume: 199 Pages: 259-263
  • DOI: 10.1016/j.vetpar.2013.10.013.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular basis for the reverse reaction of African human trypanosomes glycerol kinase (2014)
  • Author(s): Emmanuel Oluwadare Balogun, Daniel Ken Inaoka, Tomoo Shiba, Yasutoshi Kido, Chiaki Tsuge, Takeshi Nara, Takashi Aoki, Teruki Honma, Akiko Tanaka, Masayuki Inoue, Shigeru Matsuoka, Paul A.M. Michels, Kiyoshi Kita, Shigeharu Harada
  • Journal Title: Molecular Microbiology Volume: 94 Pages: 1315–1329
  • DOI: 10.1111/mmi.12831.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Probing the ubiquinol-binding site of recombinant Sauromatum guttatum alternative oxidase expressed in E. coli membranes through site-directed mutagenesis (2014)
  • Author(s): Luke Young, Benjamin May, Alice Pendlebury-Watt, Julia Shearman, Catherine Elliott, Mary S. Albury, Tomoo Shiba, Daniel Ken Inaoka, Shigeharu Harada, Kiyoshi Kita, Anthony L. Moore
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics Volume: 1837 Pages: 1219-1225
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2014.01.027.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 高度好熱菌Sulfolobus tokodai由来シスタチオニン合成酵素の結晶構造 (2014)
  • Author(s): 川村あやか、花田尚子、山田哲也、田村隆、佐藤暖、志波智生、稲垣賢二、原田繁春
  • Organizer: 第８７回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2014-10-16 – 2014-10-16
• [Presentation] Pseudomonas putida由来メチオニンγ-リアーゼの結晶構造解析 (2014)
  • Author(s): 湯之戸俊介、安田江里、古谷和大、福本充樹、工藤大蔵、志波智生、佐藤暖、田村隆、原田繁春、稲垣賢二
  • Organizer: 第８７回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2014-10-16 – 2014-10-16
• [Presentation] 赤痢アメーバ由来メチオニンγ-リアーゼの構造生物学的研究 (2014)
  • Author(s): 坂井菜摘、近藤輝、岡知宏、唐木剛、村野祥子、野崎智義、佐藤暖、原田繁春、志波智生
  • Organizer: 第８７回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都市
  • Year and Date: 2014-10-16 – 2014-10-16
• [Presentation] Crystal structures of Pseudomonas putida L-methionine γ-lyase and its C116H mutant enzyme complexed with substrate: Insights into the substrate recognition mechanism (2014)
  • Author(s): Eri Yasuda, Mitsuki Fukumoto, Kazuo Furutani, Syunsuke Yunoto, Takashi Tamura, Tomoo Shiba, Dan Sato, Shigeharu Harada and Kenji Inagaki
  • Organizer: The Fourth International Conference on Cofactors
  • Place of Presentation: イタリア パルマ市
  • Year and Date: 2014-08-25 – 2014-08-28
• [Presentation] 赤痢アメーバ由来メチオニンγリアーゼ２の結晶構造解析 (2014)
  • Author(s): 近藤 輝、酒井菜摘、岡 知宏、村、唐木 剛、野崎 智義、佐藤 暖、志波 智生、原田 繁春
  • Organizer: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-06-26 – 2014-06-26
• [Presentation] Pseudomonas putida由来メチオニンγリアーゼの結晶構造解析 (2014)
  • Author(s): 湯之戸俊介、古谷和大、福本充樹、工藤大蔵、志波智生、佐藤暖、田村隆、 原田繁春、稲垣賢二
  • Organizer: 第１４回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 横浜市
  • Year and Date: 2014-06-25 – 2014-06-25
• [Presentation] L-メチオニン γ-リアーゼ基質複合体のX線結晶構造解析と基質認識に関わる残基の機能解析 (2014)
  • Author(s): 安田江里，古谷和大，佐藤暖，福本充樹，工藤大蔵，志波智生，原田繁春，田村隆，稲垣賢二
  • Organizer: 日本ビタミン学会第６６回大会
  • Place of Presentation: 姫路市
  • Year and Date: 2014-06-13 – 2014-06-14