超高感度タンパク質ＮＭＲシグナル帰属技術

2012 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 23370056
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 河野 俊之 北里大学, 医学部, 講師 (40416657)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2014-03-31
• Keywords: 生体高分子 / NMR / タンパク質 / 安定同位体標識 / 微量解析 / 無細胞タンパク質合成

Research Abstract

タンパク質ＮＭＲ解析を、1 mg 以下かつ10 μM以下の濃度で可能にするために、我々が開発してきたＭＡＧＩＣＡＬ法をさらに発展させるとともに、ピンポイントの安定同位体標識技術の開発を試みた。今年度は、以下のような研究成果が得られた。
本年度は、昨年度に引き続き、各種アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を大腸菌による大量発現系を用いて大量培養を行い、精製を行った。特にメジャーコドンとマイナーコドンの切り分けの最初のターゲットであるロイシルｔRNA合成酵素、イソロイシルｔRNA合成酵素、メチオニルｔRNA合成酵素、伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ）の発現菌の大量培養および高純度精製を完了した。また、イソロイシンなどのアミノ酸に対応するマイナーｔRNAの遺伝子を用いて、各種ｔRNAをRNAポリメラーゼを用いた転写反応によって大量調製を行った。今年度はピンポイント安定同位体標識を行うモデルタンパク質としてFKBPを用い、アミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識を行った。メチル基を持つアミノ酸についてアミノ酸残基番号選択的な安定同位体標識を試みたところ、我々の構築した系が問題なく適用可能なことが示された。また、無細胞タンパク質合成において伸長因子（ＥＦ－Ｔｕ）を加えておくことによりアミノアシルｔRNAの分解を抑えることができた。メチル基を持つアミノ酸をアミノ酸残基番号選択的に安定同位体標識することにより、従来の方法では帰属が困難であったメチル基由来のシグナルの帰属を10μM以下の試料濃度で簡単に行えることが示された。
本研究が進めば、従来のNMR解析方法に必要であったタンパク質濃度の1/100以下の濃度でシグナル帰属解析が可能になり、様々な分野への貢献が期待できる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

交付申請書に記載した実験計画はほぼ達成できているので、おおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

ピンポイント安定同位体標識方法の開発については、タンパク質と薬剤の相互作用の解析などを念頭に置き、結合表面における疎水性相互作用に重要と考えられる、ロイシン、イソロイシン、メチオニンなどの疎水性アミノ酸のアミノ酸残基番号選択的標識方法の開発を今年度に引き続き先行させていきたいと考えている。