2012 Fiscal Year Annual Research Report
Ｐ型イオンポンプ作動機序特性の分子基盤とその異常による病態
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23370058
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| Research Institution | Asahikawa Medical College |
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Principal Investigator |
鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 和生 旭川医科大学, 医学部, 講師 (60241428)
大保 貴嗣 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (90207267)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Ca-pump / Ca-ATPase / Sarcoplasmic reticulum / Phosphorylation / Structural analog / Metal fluoride / Reaction intermediate / Active transport |
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| Research Abstract |
１．Aドメイン/M2リンカー：長さとαへリックス部分構造を改変した変異体について速度論、各リン酸化中間体構造、Ca2+閉塞・放出の解析を実施し、リン酸化中間体の異性化・Ca2+放出と加水分解における本リンカーの長さと二次構造変化の意義を解明し、構造変化の必須領域を絞り込むことにも成功した。そして非リン酸化酵素のCa2+結合による活性化における本リンカーの構造的役割を解明することが今後の必須の課題であり、これにより触媒部位と輸送部位の間の相互応答の仕組みをさらに深く理解できることを示した。
２．N-Pドメイン間long-range静電相互作用：N-Pドメイン連結へリックス上の荷電残基および両ドメイン表面の荷電残基に部位特異的置換を導入し、リン酸化中間体異性化反応に対する塩濃度変化の影響を解析した。また、コンピューターシュミレーションにより塩溶液中の荷電残基間の静電相互作用を解析した。そして両ドメイン表面の30Åも離れた荷電残基間のlong-rangeの静電相互作用はリン酸化中間体異性化を著明に促進することを発見した。連結へリックス上の残基およびPドメインへの特異的K+結合はこのN-Pドメイン間long-rangeの静電相互作用の形成に必須な役割を果たしていた。
３．Ca2+-ATPaseとベリリウムフッ素から形成したリン酸化中間体（E2P）の構造アナログ（E2BeF3-）について、膜内Ca2+輸送部位構造状態と細胞質ドメイン集合状態に対するpHおよびMg2+の影響を調べた。その結果、輸送部位のCa2+配位残基がH+結合しない中性条件では、Mg2+が輸送部位に結合してCa2+結合型リン酸化中間体（E2PBeF3-Ca2）構造となることを明らかとした。そして今後の課題として、Ca2+輸送に不都合なMg2+結合がどのような仕組みで阻止されるかを解明することが必須であることを提示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画した研究が極めて高いレベルで進行している。実際その内容は、3rd International Workshop on Expression, Structure and Function of Membrane Proteins （Florence, Italy; September 23-27, 2012）における招待講演（Keynote Lecture）および東京大学分子細胞生物学研究所セミナー「Frontiers in P-type ATPase research 2012」の招待講演として発表され、極めて高い評価を得た。
現在、さらに研究を展開するとともに、数報の論文として発表すべく、投稿・査読中あるいは投稿準備中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の「研究実績の概要」で述べた項目１．および３．の今後に残された課題を解決するための研究をさらに発展させる。
他方、Ca2+ポンプを含めたP-typeカチオンポンプの作動機構とその差異の理解を深め、さらにポンプ一分子の構造変化をポンプ作動時に実際に解析するため、BeF3-（共有結合リン酸）、AlF4-（遷移状態）、MgF42-（非共有結合Pi）を用いた各安定リン酸化中間体構造アナログも利用して、P-typeカチオンポンプ一分子観察を可能とするシステムを開発する。
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