2012 Fiscal Year Annual Research Report

冠動脈・心外膜前駆細胞の動態とその制御

Research Project

Project/Area Number	23370092
Research Institution	Kyoto Sangyo University
Principal Investigator	石井泰雄京都産業大学, 総合生命科学部, 助教 (20582430)
Project Period (FY)	2011-04-01 – 2016-03-31
Keywords	器官形成 / 心臓 / 心外膜原基 / 鳥類胚
Research Abstract	心臓がたえず拍動を続けられるのは、心臓内部を走る冠動脈が酸素と栄養分を心筋に供給するからである。冠動脈の重要な起源の一つが心外膜原基である。心外膜原基は発生過程の特定の時期に心臓の外に生じる中胚葉性の突起であり、心臓表面へと向かう成長および接着を経て心臓と融合する。この融合は、心臓の発生にとって必要不可欠なイベントであるが、そのメカニズムはよくわかっていない。心外膜原基の融合は常に心臓の決まった部位で起こる。平成23年度の観察から、心臓表面と心外膜原基の間の親和性が心外膜原基の融合部位を決めている可能性が示された。平成24年度は、その可能性について実験発生学的手法により検討した。In vitro三次元共培養法を用いて、心外膜原基と本来融合の起こる房室接合部を互いに接触した状態で培養したところ、本来融合の起こらない心房を用いた場合よりも高い頻度で融合が観察された。これは心外膜原基の心臓への融合が、両者の間の直接の接触を介したメカニズムによって制御されるという考えを支持している。また上記のメカニズムが実際に生体内で働いているかどうかを検討するために必要なin vivo実験系を確立した。ウズラ由来の心臓断片をニワトリ胚の心外膜原基近傍へと移植したところ、3時間後には心外膜原基と移植片の間の融合が観察され、今後さらに解析を進めていくこととなった。加えて、マイクロアレイ法を用いた解析を行い、心外膜原基の融合に関わる分子に関する情報を得るとともに、接触依存性の細胞間相互作用に関与するephrin, Eph遺伝子群を単離した。以上のように、平成24年度は冠動脈発生の初期イベントに関する仮説を実験的手法により検討するともに、今後の細胞レベル、分子レベルでの解析の基盤となる実験技術および情報を得た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成24年度は、主に心外膜原基の心臓への融合メカニズムに関して重点的に解析を行い、平成23年度の観察結果から導きだされた心外膜原基の心臓への融合機構に関する仮説を支持するin vitro培養実験の結果を得た。In vivo組織移植の技術を確立し、今後の解析に用いることとなった。また、マイクロアレイ解析等により、今後の分子レベルでの解析の基礎となる心外膜原基の融合に関わる遺伝子候補に関する情報を得た。以上の点から、研究はおおむね順調に進行していると言える。
Strategy for Future Research Activity	心外膜原基の心臓への融合を制御するメカニズムに関して、細胞レベルおよび分子レベルでの解析を進める。上皮組織同士の融合に関与していると考えられている細胞極性の変化および細胞死の役割について検討するため、in vitro共培養系、in vivo組織移植系での、マーカー分子の分布の経時解析を行う。細胞極性に関わる分子の中には、シグナルが弱く免疫染色の結果が安定しないものもあるが、抗原抗体反応を促進する薬剤やチラミド等を利用したシグナル増強により改善が可能と思われる。心外膜原基の融合を制御するメカニズムを分子レベルで明らかにするため、マイクロアレイ解析のデータ等を参考にしつつ、in situハイブリダイゼーションによる発現パターン解析、免疫組織化学によるシグナル伝達分子の検出、in vitro培養系への因子の添加、遺伝子導入等を行う。上記の解析に加えて、心外膜原基融合部位が制御されることの発生学的意義を調べる。ニワトリおよびウズラを用いて、心外膜原基の心臓表面への異種間移植を行い、心外膜原基の融合部位を変更させることが、その後の心臓の発生に必要な位置情報、とりわけ冠動脈の走行決定メカニズムにどのような影響を与えるかどうかを調べる。平成26年度以降は、上皮間充織転換を始めとする心外膜原基由来細胞の心臓進入後の振る舞いと冠動脈発生の関係に関する解析を行う予定である。解析には、エレクトロポレーションによる遺伝子導入、幹細胞マーカーの解析、鳥類以外の動物門との比較などが含まれる。これらの解析により、正常な冠動脈の発生に必要な細胞の振る舞いやそれに関わる分子が明らかになるとともに、器官形成における組織融合のメカニズムおよび意義に関する新たな知見が得られることが期待できる。