2012 Fiscal Year Annual Research Report
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23380053
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| Research Institution | Fukuyama University |
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Principal Investigator |
藤田 泰太郎 福山大学, 生命工学部, 教授 (40115506)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
広岡 和丈 福山大学, 生命工学部, 准教授 (20389068)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 応用微生物 / 緊縮応答 / 発現制御 / ゲノム / 枯草菌 / 胞子形成 / 緊縮転写制御 / プリン合成 |
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| Research Abstract |
枯草菌は自然界で一般的に栄養的に極めて劣悪な状況におかれる。そのため、枯草菌にとって栄養劣悪時に作動する緊縮制御が常態となり、またカタボライト抑制も解除していると類推できる。この緊縮制御下の代謝ネットワークの動態を把握するため、まず、根圏に豊富なラムノースの分解系オペロン(yuxG-yulBCDE)のラムノースによる誘導とそのカタボライト抑制機構を明らかにした。このオペロンのリプレッサーと思われるYulBのDNase Iフットプリントで、そのプロモーターのダイレクトリピートを含む領域に結合した。また、この制御領域にはCcpAの認識配列であるCREが含まれており、このCREにCcpAとP-Ser-HPr複合体が結合した。次に枯草菌の緊縮応答による胞子形成の開始機構の解明を行った。緊縮応答によるGTP合成系の阻害により、GTPの減少とATPの増加が引き起こされる。このヌクレオチドの変動を感知する転写開始点のプリン塩基種に依存した緊縮転写制御系が作動し、転写開始点にAが有りGが無ければ転写の活性化、Aが無くGが有れば不活性化する。GMP合成阻害剤のデコイニンの添加は、緊縮制御と同様にGTPの減少とATPの増加を引き起こし、胞子形成を誘導する。緊縮制御のDNAマイクロアレイ解析で、胞子形成の引き金となるリン酸リレー系に関与するkinAとkinBの発現が上昇した。そこでkinAとkinBのLacZレポーター解析を行い、転写開始点A(+1)をGまたはCに変換するとこの緊縮制御による誘導が起こらなくなることを確認した。さらに、ゲノム上の転写開始点のAをGまたはCに変換した菌株を作成したところ胞子形成能を影響した。以上の結果より、生体内のATPの高濃度を転写開始点のAに依存したkinAとkinBの転写の活性化で感知することが、胞子形成開始の前提条件であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
枯草菌の胞子形成は分子レベルの解析が最も進んだ細胞分化系として周知されている。しかしながら、胞子形成の開始に関わる代謝制御の研究は遅々として進まなかった。この度、緊縮制御ネットワークの大きな位置を占める胞子形成開始の代謝制御機構を解明でき、その研究成果をJournal of Bacteriologyに投稿したが、審査員から実験データの補充を要求され、新たにkinAとkinBの転写開始点のAをCにした変異プロモーターをもつ菌株をも作成した。これらの変異株を用いての実験の結果、胞子形成に必要なkinAとkinBの正の緊縮転写制御は転写開始点がAでなければ起こらないことを証明した。これらのデータを加え、再投稿したところ本年1月にJournal of Bacteriologyに受理された。また、緊縮制御研究の一環として実施した、ラムノースオペロンの誘導系とそのカタボライト制御の分子レベルでの研究は順調に進展し、その研究成果を3月の平成25年度日本農芸化学会大会で発表した。また、負の緊縮制御下にあるグルコース取り込み系(pts)やアセチルCoAの合成に与るピルビン酸脱水素遺伝子(pdh)の転写の開始点のG塩基をAに換える実験は、ptsの方は菌株が作成できたが、pdhの方はまだ作成に至っていない。尚、この緊縮制御の全体像を捉えるための体系的な緊縮制御遺伝子の特定とその転写開始点の塩基種の同定研究は計画通りには進展せず、25年度への継続研究課題とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である平成25年度は、24年度の研究計画の積み残しである計画１とkinAとkinBの関与する胞子形成開始機構（計画２）とラムノースオペロンの誘導系の詳細な解析（計画3）を遂行する。
１．緊縮条件と非緊縮条件下でのRNAを用いてcDNAを合成して、次世代シーケンサーを用いて、その塩基配列情報を得る。それら配列情報を、ゲノム配列に貼り付け、デコイニン添加等の緊縮制御条件で変動するオペロン群を特定すると共に、発現している全オペロンの転写開始点の情報を得る。このようにして、枯草菌の緊縮制御ネットワークを構成しているオペロンとその転写開始塩基とその周辺の配列を明らかにし、枯草菌の転写開始部位のプリン塩基種に依存した緊縮転写制御の全貌を明らかにする。
２．胞子形成の開始にはフォスフォリレーにリン酸基を供給するkinAとkinBの正の緊縮転写制御の作動が必要であることを明らかにしてきた。これら遺伝子の種々の制御部位を含むプロモーター領域をレポーターであるβ-ガラクトシダーゼ遺伝子と融合して、種々の制御因子の欠失状態および種々の培地条件での胞子形成開始時における発現状況を追跡する。さらに、これらプロモータ領域の欠失解析を行いこれらの遺伝子の発現制御に関わる制御因子の制御部位を特定する。
３．ラムノース資化に与るyuxG-yulBCDEオペロンのラムノースによる転写誘導系とそのCcpAとP-Ser-HPrによるカタボライト抑制の機構を明らかにした。このオペロンはDeoRファミリーの転写制御因子のYulBによって特異的に抑制される。他のこのファミリーの転写因子の場合と同様に、YulBレプレッサーの誘導物質であるラムノースの代謝中間体であるリン酸化糖が生体内の真の誘導物質となって脱抑制されると思われるので、このラムノースの代謝中間体を同定する。
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