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2012 Fiscal Year Annual Research Report

細胞内物流システム制御におけるカルシウム依存性アダプター蛋白質ALGー2の役割

Research Project

Project/Area Number 23380056
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

牧 正敏  名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (40183610)

Project Period (FY) 2011-04-01 – 2014-03-31
KeywordsALG-2 / 結合モチーフ / 結晶構造 / タンパク質間相互作用 / 細胞質顆粒 / 核内スペックル / スプライシング / カルシウム結合タンパク質
Research Abstract

(1)ALG-2の相互作用因子であるPLSCR3が細胞外にエクソソームと称される膜小胞に含まれた状態で分泌される仕組みを明らかにした。この分泌はセラミド合成阻害剤やパルミトイル化阻害剤添加によって抑制された。エンドソーム選別輸送複合体(ESCRT)の機能を阻害するVPS4Bの優勢機能抑制変異体の過剰発現により細胞外分泌が抑制され、多胞性エンドソームに蓄積した。PLSCR3は多胞性エンドソームが形質膜と融合し、その内部小胞が細胞外に放出されて分泌されると思われる。ALG-2結合部位の欠損変異体でも分泌されることより、ALG-2のPLSCR3への結合が直接分泌に作用する可能性は低い。2)ALG-2結合モチーフには少なくとも2種類あり、I型については結晶構造により既に分子認識機構を解明していた。II型についてPLSCR3由来ペプチドとの共結晶化は不成功であったが、結合部位のシミュレーションおよび変異体解析より、結合部位を推定した。また、Sec31A由来ペプチドとの共結晶化に成功し、構造の一端を解明することができ、I型とは異なる部位に結合することが判明した。今後は詳細な変異体解析が必要である。(3)ALG-2と相互作用する新規タンパク質としてPATL1ならびにCHERPを同定した。PATL1は細胞質においてmRNAの分解、翻訳抑制を行うことが知られており、P-bodyという非膜性の構造物を形成するが、それぞれの特異抗体を調製することにより、ALG-2も一部がP-bodyに斑点状に存在することを蛍光顕微鏡観察による細胞内局在解析により明らかにした。CHERPはSer/Argに富むSRタンパク質ファミリーに属すこと、核内でSC35やSF3A2と同様に核スペックルとして存在することが判明し、pre-mRNAのスプライシングに関与していることが示唆された。さらに、新規ALG-2相互作用因子としてESCRTシステムで機能するIST1とVPS37を見出した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

構造生物学的研究においては、年度内に結晶構造を完全解明する予定であったが、当初、共結晶化に失敗したがタンパク質の精製条件ならびにペプチドの残基数を変えることにより結晶化に成功した。データ取得が遅れたため、構造の精密化が遅れ、さらに変異体解析などに遅れが生じているが、共結晶が得られたことは非常に大きな成果である。新規相互作用タンパク質探索についてはおおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

構造生物学的解析は、データ取得が遅れたため、構造の精密化が遅れ、さらに変異体解析などに遅れが生じているが、共結晶が得られたことは非常に大きな成果であり、今後の展開は当初計画通りに遂行可能である。また、新規相互作用タンパク質CHERPとALG-2の核内局在に及ぼすカルシウムの影響を検討するため、蛍光顕微鏡を用いた生細胞イメージング観察を行う必要があり、蛍光タンパク質融合発現プラスミドを構築する必要がある。また、選択的スプライシングにおよぼす影響を解析するための評価系の確立が必要である。

  • Research Products

    (15 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 6 results) Presentation (8 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] ALG-2-interacting Tubby-like protein superfamily member PLSCR3 is secreted by exosomal pathway and taken up by recipient cultured cells.2013

    • Author(s)
      Inuzuka T, Inokawa A, Chen C, Kizu K, Narita H, Shibata H, Maki M.
    • Journal Title

      Bioscience Reports

      Volume: 33(2) Pages: e00026

    • DOI

      10.1042/BSR20120123

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Biochemical and immunological detection of physical interactions between penta-EF-hand protein ALG-2 and its binding partners.2013

    • Author(s)
      Kanae Osugi
    • Journal Title

      Methods in Molecular Biology

      Volume: 963 Pages: 187-200

    • DOI

      10.1007/978-1-62703-230-8_12

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Identification of the P-body component PATL1 as a novel ALG-2-interacting protein by in silico and Far-Western screening of proline-rich proteins.2012

    • Author(s)
      Kanae Osugi
    • Journal Title

      Journal of Biochemistry

      Volume: 151 Pages: 657-666

    • DOI

      10.1093/jb/mvs029

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Evolutionary and physical linkage between calpains and penta-EF-hand Ca2+ -binding proteins.2012

    • Author(s)
      Masatoshi Maki
    • Journal Title

      FEBS Journal

      Volume: 279 Pages: 1414-1421

    • DOI

      10.1111/j.1742-4658.2012.08560.x.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] ESCRT and calpain - old and new relationships.2012

    • Author(s)
      Masatoshi Maki
    • Journal Title

      FEBS Journal

      Volume: 279 Pages: 1398

    • DOI

      10.1111/j.1742-4658.2012.08561.x.

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Prediction of a New Ligand-Binding Site for Type 2 Motif based on the Crystal Structure of ALG-2 by Dry and Wet Approaches.2012

    • Author(s)
      Takeshi Takahashi
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Science

      Volume: 13 Pages: 7532-7549

    • DOI

      10.3390/ijms13067532

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] ALG-2相互作用因子CHERPの細胞内局在および選択的スプライシング制御機能2013

    • Author(s)
      大杉桂奈江
    • Organizer
      日本農芸化学会2013年度大会
    • Place of Presentation
      東北大学
    • Year and Date
      20130325-20130327
  • [Presentation] Analyses of intracellular localization of SR-like protein CHERP and its function in alternative splicing2012

    • Author(s)
      Osugi K, Imoto C, Shibata H, Maki M
    • Organizer
      第35回日本分子生物学会
    • Place of Presentation
      福岡国際会議場
    • Year and Date
      20121211-14
  • [Presentation] The penta-EF-hand protein ALG-2 stabilises a COPII component Sec31A at ER exit sites by recruiting annexin A112012

    • Author(s)
      Hideki Shibata
    • Organizer
      European Calcium Society
    • Place of Presentation
      Hotel Dieu,Toulouse, France
    • Year and Date
      20120909-20120912
  • [Presentation] Identification of RNA-processing-related factors PATL1 and CHERP as novel ALG-2-interacting proteins2012

    • Author(s)
      Kanae Osugi
    • Organizer
      European Calcium Society
    • Place of Presentation
      Hotel Dieu,Toulouse, France
    • Year and Date
      20120909-20120912
  • [Presentation] How can ALG-2 recognize two different binding motifs and function as a Ca2+-dependent adaptor?2012

    • Author(s)
      Takeshi Takahashi
    • Organizer
      European Calcium Society
    • Place of Presentation
      Hotel Dieu,Toulouse, France
    • Year and Date
      20120909-20120912
  • [Presentation] 新規ALG-2相互作用因子CHERPのpre-mRNAスプライシング制御における機能解析2012

    • Author(s)
      大杉桂奈江, 井元千晶, 柴田秀樹, 牧正敏
    • Organizer
      第165回日本農芸化学会中部支部例会
    • Place of Presentation
      名古屋大学
    • Year and Date
      2012-10-27
  • [Presentation] SR様タンパク質ファミリーに属すCHERPのRSドメイン依存的な細胞内局在変化

    • Author(s)
      大杉桂奈江
    • Organizer
      第76回日本生化学会中部支部例会
    • Place of Presentation
      岡崎カンファレンスホール
  • [Presentation] Phospholipid scramblase 3のエキソソーム経路による細胞外分泌に関する研究

    • Author(s)
      犬塚達俊
    • Organizer
      第165回日本農芸化学会中部支部例会
    • Place of Presentation
      名古屋大学
  • [Remarks] 名古屋大学教員データベースシステム

    • URL

      http://profs.provost.nagoya-u.ac.jp/view/html/100003692_ja.html

URL: 

Published: 2015-05-28  

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