2014 Fiscal Year Annual Research Report
セレン含有タンパク質生合成に関わるセレン特異的化学変換機構の解明
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23380060
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
三原 久明 立命館大学, 生命科学部, 教授 (30324693)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 酵素 / セレン / 必須微量元素 / セレン蛋白質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、 Pseudomonas sp. F2a 株由来セレノリン酸合成酵素のカイネティクス解析および大腸菌欠損株を用いたインビボ試験による基質供給源の同定を行った。Pseudomonas sp. F2a セレノリン酸合成酵素をコードする遺伝子 selD を pColdI に組み込み、pColdI_F2a_selD を作製した。これを E. coli BL21(DE3) に導入し、発現したHis-tag 融合タンパク質を Ni-NTA カラムを用いて精製した。本酵素の活性は好熱菌由来ピルビン酸リン酸ジキナーゼ (PPDK) と乳酸脱水素酵素 (LDH) を用いた共役アッセイ法により測定した。ジチオスレイトール (DTT) を用いて合成したセレニドに対する Km 値は 15.7 microM、F2a チオレドキシンを用いた場合は 8.47 microM となった。また、還元型グルタチオン (GSH) や β-メルカプトエタノールを用いた場合は反応が圧倒的に遅く、測定が困難であった。このことから、DTT やチオレドキシンのような分子内に二つのチオール基を持つ還元分子が効率よくセレノリン酸合成酵素へ基質を供給していることが明らかとなった。また、E. coli のセレンタンパク質であるギ酸脱水素酵素活性を指標としてセレンタンパク質合成に関与する遺伝子の探索を行った。E. coli の一遺伝子欠損株コレクションに対するギ酸脱水素酵素活性を評価した結果、trxA の欠損株において活性の低下が見られた。trxA はチオレドキシンをコードしているため、チオレドキシンがセレンタンパク質生合成に関与している可能性が示唆された。また、グルタチオン合成酵素をコードする gshB の欠損株においては活性の低下が見られなかった。以上より、インビボ (カイネティクス) の結果とインビトロの結果から GSH ではなくチオレドキシンがセレンタンパク質合成に関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度当初の計画中に、セレンタンパク質生合成装置として機能するタンパク質巨大複合体の同定が含まれていたが、本複合体の同定には技術的な課題がいくつか残っており、未だ解析に至っていない。この点においては課題があるものの、全体としては概ね順調に進展している。ここ最近の予備的実験から解決の糸口が見つかってきているので、今後の研究の進展が期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の現在までの達成度でも述べたように、セレンタンパク質生合成装置として機能するタンパク質巨大複合体の同定が今後の大きな解明のポイントになる。最近の予備的実験より解決の糸口が見つかってきたので、今後は、着実に研究を進め、セレンタンパク質生合成装置の全貌を明らかにする方針である。
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[Presentation] 高濃度セレン地帯土壌より単離した Cellulomonas sp. D3a の亜セレン酸還元特性2014
Author(s)
田島寛隆, 岡林拓弥, 山際恭平, 山本紘資, 名田イサナ, 斎藤茂樹, 谷泰史, 峯元高志, Prakash, N. T., 三原久明
Organizer
第4回メタロミクス研究フォーラム
Place of Presentation
武蔵野大学（東京都）
Year and Date
2014-11-07
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[Presentation] Physiological role and reaction mechanism of selenocysteine lyase: unique vitamin B6 enzyme acting specifically on selenocysteine2014
Author(s)
Esaki, N., Kurokawa, S., Omi, R., Hayashi, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Kurihara, T., and Mihara, H.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactor (ICC-04)
Place of Presentation
Parma (Italy)
Year and Date
2014-08-27
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[Presentation] The unique multiheme selenoprotein of the metal-reducing anaerobic bacterium Geobacter sulfurreducens2014
Author(s)
Mihara, H., Tani, Y., Shinno, E., Sugiyama, S., Shimamoto, N., Zhang, W., Saito, S., Kurihara, T., and Esaki, N.
Organizer
The Fourth International Conference on Cofactor (ICC-04)
Place of Presentation
Parma (Italy)
Year and Date
2014-08-26
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