2012 Fiscal Year Annual Research Report
キチナーゼ様タンパク質の機能を鍵としたアロサミジン類の抗喘息作用の分子機構解析
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23380062
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
作田 庄平 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (80192087)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | アロサミジン / 喘息 / キチナーゼ / キチナーゼ様タンパク質 |
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| Research Abstract |
キチナーゼ阻害物質アロサミジン（allo）は喘息モデルマウスに対して抗喘息作用を示す。研究代表者はこれまでに、デメチルアロサミジン（dmallo）はalloよりすぐれた抗喘息作用を示すが、両者の活性の違いは哺乳類酸性キチナーゼAMCaseに対する作用に起因するものではないこと、また喘息モデルマウスの肺胞洗浄液中でallo類と特異的に結合する主タンパク質はキチナーゼ様タンパク質Ym1であることを明らかにした。AMCase、Ym1および他のキチナーゼ様タンパク質BRP39が喘息の発症と関与するとの報告はあるが、それらの機能は不明である。本研究では、dmalloとalloの作用と両者の活性の違いを手がかりに、キチナーゼおよびキチナーゼ様タンパク質の機能の分子機構、allo類の抗喘息作用機構を明らかにすることを目的とし、昨年度に引き続きYm1、AMCase、BRP39およびYm2の組換え体タンパク質の調製を行いallo類との相互作用解析を試みることにした。昨年度のGSTタグからMBPタグに変更し、大腸菌を用いた発現系により、Ｎ末端にMBPタグを付加した融合タンパク質MBP-rYm1, MBP-rYm2, MBP-rAMCaseおよびMBP-rBRP39を調製を試みた。組換えタンパク質の可溶性画分での発現には成功したが、MBPのアフィニティーカラムで精製後に分解産物と考えられるバンドが存在していた。そこで、発現誘導時間、発現誘導温度、プロテアーゼインヒビターの有無、カラムでの精製時の温度条件を検討し、また、逆相HPLC、陰イオン交換HPLC、ゲルろ過HPLCによる精製を検討した。その結果、分子間相互作用解析装置での分析が可能な純度の４種のタンパク質の組換え体を調製することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度中にアロサミジン類と喘息に関与するキチナーゼおよびキチナーゼ様タンパク質との相互作用解析を行う予定であったが、組換えタンパク質のタグの選択と分解産物の除去の問題が発生し、当初の予定より半年程度の遅れで組換えタンパク質の調製が完了した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度調製した組換えタンパク質とアロサミジン類およびそれらの各種プローブを用いて、生体分子間相互作用解析装置により、キチナーゼ、キチナーゼ様タンパク質とアロサミジン類の結合の強さを調べ、アロサミジン類の抗喘息作用に関与するタンパク質を特定する。また、キチナーゼ様タンパク質の生物活性を検定する系を構築し、アロサミジン類の効果を調べる。
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