2013 Fiscal Year Annual Research Report
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23380200
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
人見 清隆 名古屋大学, 創薬科学研究科, 教授 (00202276)
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| Project Period (FY) |
2011-04-01 – 2014-03-31
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| Keywords | 酵素 / 蛋白質架橋 / 細胞機能 |
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| Research Abstract |
ヒトで8種あるタンパク質架橋化酵素の生体における分子基盤の確立のため、高反応性基質の活用から生理機能の解明をめざした。前年度までに表皮における新規な酵素に対する高反応性基質配列を明らかにしたので、これらの皮膚表皮における活性の変動パターン（出生時からの時間経過）を解析し、同時に基質となる蛋白質の存在パターンを調べた。さらに、これまでに詳細に明らかにされていなかったRNAレベルでの発現パターンも、マウス全体切片を用いたin situ hybridization系を試行錯誤の結果確立し、主要なアイソザイムについて明らかにした。また、全アイソザイムのRNAレベルをRT-PCR法によって測定して組織分布を明らかにした。
さらに基質の探索を行う系を確立した。肝臓、腎臓を対象にして、その組織抽出液に、基質配列に相当するペプチドを化学標識して添加し、標識分子に対する親和性を利用して、ペプチドを架橋させたタンパク質群を精製、質量分析によって同定することを試みた。すでにいくつかの分子が得られており、今後これらがin vivo で起こるか、架橋をした場合にどのような生理機能が変換されるのかを明らかにする。
また、FRET（共鳴蛍光エネルギー移行現象）による高反応性基質配列を用いた活性検出系の高感度化を試みた。これは異なる波長を出す蛍光タンパク質と配列の融合タンパク質を作製して、架橋反応に伴う波長変化での活性検出を目指したもので前年度から試みていた。当初は検出能が低かったが、タンパク質の発現条件の検討(低温誘導）により大きく改善し、検出の目途が立てられた。今後は細胞内に発現させてのライブ検出を行っていく。
また、ヒトでの知見を支援しての生理機能の解明のために、モデル生物としてのメダカを用いての、該当する酵素群の生化学的解析と、組織発現解析、遺伝子変異個体の作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Reason
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
25年度が最終年度であるため、記入しない。
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