2014 Fiscal Year Annual Research Report
Advancement of revolutional cell technology based on the IR/MAR gene amplification method
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23380203
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
清水 典明 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (10216096)
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2011-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 遺伝子増幅 / IR/MAR遺伝子増幅法 / 染色体外因子 / Double Minutes / HSR / 蛋白質生産 / エピソームベクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成26年度には、申請時の課題A~Dをもとにして、年度初めの交付申請書に、研究実施計画として記載した内容に完全に準拠して行った。すなわち、当初研究計画の課題Aで「遺伝子増幅に必要充分な配列」としてbeta-globinのIRからG５配列（900 bp）を得て平成25年度に論文発表した。26年度には、この配列をInverted repeat、あるいはdirect repeatの形に試験管内でライゲーションし、それを、目的遺伝子を持つプラスミドとコトランスフェクションによりヒト大腸がんCOLO 320細胞やハムスターCHO DG44細胞へ導入した。その結果、目的遺伝子を持つプラスミドは、inverted repeatを用いた場合には染色体外で増幅した。染色体外は発現抑制を受けにくい環境である。またdirect repeatを用いた場合には染色体上で、G5が数十コピー連続した中に目的遺伝子が埋もれた状態となり、それを単位として増幅していた。そのため、遺伝子発現に最適な環境となり、遺伝子あたりの発現効率は極めて高くなった。さらに、当初研究計画の課題Ｃで得られた「増幅した配列からの発現を高めるゲノム配列（B-3-31配列；約3.2 kbp）を、同様にrepeat として細胞に導入すると、極めて高い遺伝子発現が見られた。これらの成果は、特許出願するとともに、論文発表準備中である。一方、当初研究計画の課題Ｂから「低酸素状態では染色体外因子が維持されやすい」という発見が得られた。このことを元に、ヒト-マウスの細胞融合によりヒト染色体が断片化する実験系で、安定なＤＭが効率よく形成・維持されることが見いだされた。この成果は現在論文投稿中である。さらに、当初研究計画の課題Ｄに関連して、微小核の細胞外放出に関し、微小管とアクチン繊維の関与を系統的で緻密な実験により明確にした。この点も投稿準備中である。
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| Research Progress Status |
平成26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度が最終年度であるため、記入しない。
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