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2012 Fiscal Year Annual Research Report

植物における膜結合型転写因子による遺伝子発現制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number 23380206
Research InstitutionOsaka Prefecture University

Principal Investigator

小泉 望  大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (20252835)

Project Period (FY) 2011-04-01 – 2015-03-31
Keywords小胞体ストレス応答 / 細胞質スプライシング / RNA分解 / シロイヌナズナ / 転写因子
Research Abstract

シロイヌナズナの膜結合型転写因子であるbZIP60とbZIP28の活性化機構、さらに前年度の研究で明らかとなったbZIP60の活性化に関わるIRE1に着目し、小胞体ストレス応答の分子機構を中心に以下の研究を行った。
IRE1遺伝子破壊株はツニカマイシンに対して感受性を示すが、bZIP60遺伝子破壊株は感受性を示さないことから、IRE1はbZIP60 mRNAの細胞質スプライシング以外の機能を持つと考えられた。マイクロアレイ解析の結果を詳細に解析した結果、野生型では小胞体ストレスにより、小胞体で合成されるタンパク質をコードする遺伝子の転写産物(mRNA)が分解されるのに対して、IRE1遺伝子破壊株では分解が見られないことが示された。定量的PCR等による詳細な解析からIRE1が小胞体ストレス依存的に小胞体で合成されるタンパク質のmRNAを分解することが示された。
病原菌応答で重要な役割を果たすサリチル酸処理によりbZIP60の活性化が見られることを発見した。遺伝子破壊株を用いた解析から、この活性化はIRE1に依存することが明らかとなった。bZIP60の活性化機構を詳細に解析するため、変異導入したbZIP60遺伝子をbZIP60遺伝子破壊株に導入した。
BiP3プロモーター制御下で働くGUS遺伝子が恒常的に発現している2つの変異体に関して、次世代シーケンサーを用いた解析により、1つの変異体に関しては原因遺伝子の同定に成功した。
bZIP28にFLAGタグを付加した遺伝子を導入したトランスジェニック植物が得られたが、ウエスタンブロットの結果は明瞭で無く、bZIP28の切断を検出する系の確立には至らなかった。一方、S2P破壊株では小胞体関連遺伝子の誘導が抑制されるのに対し、S1P破壊株では抑制は見られず、S1PがbZIP28の切断に関与しない可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

IRE1は酵母、動物まで広く保存されている小胞体ストレスセンサーで、bZIP型転写因子mRNAの細胞質スプライシングを触媒する。さらに、動物のIRE1は小胞体で合成されるタンパク質のmRNAを分解するなど多くの機能を持つ。植物のIRE1については殆ど知見が無かったが、昨年度のbZIP60 mRNAの細胞質スプライシングの発見に続き、IRE1によるmRNA分解を発見し、PNAS誌に報告できたことは研究開始時に想定していなかった大きな進展と考えている。
サリチル酸によるbZIP60の活性化に関しては本研究遂行中に米国のグループから論文発表が行われたが、我々のデータとは合致しない。本研究の成果が正しいことを示す複数の結果を得ており、早い時期に論文発表を行いたい。
恒常的にBiP3プロモーターに制御されるGUS活性を示す変異体の遺伝子同定は次世代シーケンサーの利用により、当初の想定よりも非常に迅速に行うことができた。一方、この変異体はGUS活性に加えてBiP3タンパク質も恒常的に発現しているが、GUSおよびBiP3のmRNAの恒常的な発現が確認できておらず、その原因の解明は今後の課題である。
bZIP28のS1PとS2Pによる2段階の切断が定説となりつつあるが、S1Pが関与していない可能性が示され、bZIP28の切断機構を再考する必要が生じた。そのためには、bZIP28の切断を効率よく、また、再現性良く検出する実験系の構築が必要である。
IRE1によるmRNA分解機構の発見など、当初の計画以上に進展した部分がある一方でbZIP28の発現に関しては明確な結果が得られていない。総合的に考慮すれば、おおむね順調に進展していると考えている。

Strategy for Future Research Activity

IRE1の遺伝子破壊株はツニカマイシンに対して感受性を示すが、この際、プログラム細胞死が起こっている。このプログラム細胞死の亢進は、bZIP60の細胞質スプライシングとは無関係と考えられ、IRE1によるmRNA分解が原因と考えられる。その確認のため、変異導入を行ったIRE1をIRE1遺伝子破壊株に導入し、細胞死への影響を観察する。また、IRE1によるmRNA分解がタンパク質合成に与える影響についても解析を行う必要がある。そのためにIRE1の標的となるmRNAがコードしているタンパク質に対する抗体を作製し、タンパク質の挙動を調べる。
恒常的にBiP3プロモーターに制御されるGUS活性を示す変異体の1つは原因遺伝子が同定できているが、もう1つは候補遺伝子が7つにまで絞られているが特定には至っていないので、その特定を進める。またmRNAレベルがタンパク質レベルと対応しない原因の解明を行う。
bZIP28の切断を確認する系の確立は必須なので、GFPの蛍光観察の技術レベルを上げることを目指す。共焦点蛍光顕微鏡が共通機器として導入されたので、その利用により解決を図る。また、bZIP28を検出できる特異抗体の調整をおこない、S1P、S2PのbZIP28切断への関与を明らかにする。

  • Research Products

    (16 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (12 results) (of which Invited: 1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Defects in IRE1 enhance cell death and fail to degrade mRNAs encoding secretory pathway proteins in the Arabidopsis unfolded protein response2013

    • Author(s)
      Mishiba KI, Nagashima Y, Suzuki E, Hayashi N, Ogata Y, Shimada Y, Koizumi N
    • Journal Title

      Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

      Volume: 110 Pages: 5713-5718

    • DOI

      10.1073/pnas.1219047110

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Role of the plant-specific endoplasmic reticulum stress-inducible gene TIN1 in the formation of pollen surface structure in Arabidopsis thaliana.2012

    • Author(s)
      Iwata, Y., Nishino, T., Iwano, M., Takayama, S., & Koizumi, N
    • Journal Title

      Plant Biotechnology

      Volume: 1 Pages: 51-56

    • DOI

      10.5511/plantbiotechnology.11.1228a

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Plant transducers of the endoplasmic reticulum unfolded protein response2012

    • Author(s)
      Iwata, Y., and Koizumi, N.
    • Journal Title

      Trends in Plant Science

      Volume: 17 Pages: 720-727

    • DOI

      10.1016/j.tplants.2012.06.014

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] The IRE1-bZIP signaling pathway in Arabidopsis unfolded protein response

    • Author(s)
      Nozomu Koizumi
    • Organizer
      GNU Plant Science Symposium 2012
    • Place of Presentation
      韓国ジンジュ市
    • Invited
  • [Presentation] Salicylic acid induces genes for the unfolded protein response depending on IRE1 and bZIP60 in Arabidopsis

    • Author(s)
      Yukihiro Nagashima, Kei-ichiro Mishiba and Nozomu Koizumi
    • Organizer
      XV International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions
    • Place of Presentation
      京都
  • [Presentation] サリチル酸による小胞体ストレス応答関連遺伝子の誘導にIRE1-bZIP60経路が関わる

    • Author(s)
      長島幸広、三柴啓一郎、鈴木英司、嶋田幸久、岩田雄二、小泉望
    • Organizer
      日本植物細胞分子生物学会
    • Place of Presentation
      奈良・生駒
  • [Presentation] 小胞体シャペロンを恒常的に発現するシロイヌナズナ変異体の単離

    • Author(s)
      飯田宰、大西陽向、三柴啓一郎、小泉望
    • Organizer
      日本植物細胞分子生物学会
    • Place of Presentation
      奈良・生駒
  • [Presentation] IRE1-bZIP60 Pathway Induces UPR genes by Salicylic Acid (SA) in Arabidopsis

    • Author(s)
      Yukihiro Nagashima, Kei-ichiro Mishiba and Nozomu Koizumi
    • Organizer
      10th International Congress on Plant Molecular Biology
    • Place of Presentation
      韓国済州島
  • [Presentation] Characterization of Arabidopsis mutants for the unfolded protein response

    • Author(s)
      Kei-ichiro Mishiba, Yukihiro Nagashima, Eiji Suzuki, Noriko Hayashi, Yoshiyuki Ogata, Yukihisa Shimada and Nozomu Koizumi
    • Organizer
      10th International Congress on Plant Molecular Biology
    • Place of Presentation
      韓国済州島
  • [Presentation] プラスチドにおける脂質合成と小胞体ストレス応答

    • Author(s)
      飯田宰、大西陽向、三柴啓一郎、倉田哲也、小泉望
    • Organizer
      日本植物脂質科学研究会
    • Place of Presentation
      兵庫・神戸
  • [Presentation] シロイヌナズナの小胞体ストレス応答において小胞体で合成されるタンパク質のmRNAがIRE1により分解される

    • Author(s)
      三柴啓一郎、長島幸広、鈴木英司、林のりこ、尾形善之、嶋田幸久、小泉望
    • Organizer
      日本植物生理学会
    • Place of Presentation
      岡山
  • [Presentation] 小胞体ストレスを指標としたシロイヌナズナ変異体の単離

    • Author(s)
      飯田宰、大西陽向、三柴啓一郎、倉田哲也、小泉望
    • Organizer
      日本植物生理学会
    • Place of Presentation
      岡山
  • [Presentation] サリチル酸によるIRE1/bZIP60 経路を介した小胞体ストレス応答関連遺伝子の誘導

    • Author(s)
      長島幸広、飯田宰、三柴啓一郎、小泉望
    • Organizer
      日本植物生理学会
    • Place of Presentation
      岡山
  • [Presentation] Salicylic acid induces UPR genes through IRE1/bZIP60 pathway in Arabidopsis

    • Author(s)
      Yukihiro Nagashima, Tukasa Iida, Kei-ichiro Misiba, Nozomu Koziumi
    • Organizer
      The 6th International Workshop on Plant Membrane Biology
    • Place of Presentation
      岡山・倉敷
  • [Presentation] Kei-ichiro Misiba, Yukihiro Nagashima, Eiji Suzuki, Noriko Hayashi, Yoshiyuki Ogata, Yukihisa Shimada, Nozomu Koizumi

    • Author(s)
      IRE1-dependent decay of mRNAs in the Arabidopsis unfolded protein response
    • Organizer
      The 6th International Workshop on Plant Membrane Biology
    • Place of Presentation
      岡山・倉敷
  • [Remarks] 小胞体と核のコミュニケーション機構の解明

    • URL

      http://www.plant.osakafu-u.ac.jp/~mishiba/Research.html

URL: 

Published: 2014-07-24  

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